Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb eredmény elérése érdekében javasoljuk, hogy a böngésző újabb verzióját használja (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílus és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A természetes termékek felfedezése és jótékony felhasználása segíthet javítani az emberi életminőséget. A növényi növekedést gátló vegyszereket széles körben használják herbicidként a gyomok irtására. Mivel különböző típusú herbicideket kell használni, szükség van új hatásmechanizmusú vegyületek azonosítására. Ebben a tanulmányban egy új N-alkoxi-pirrol vegyületet, a kumamonamidot fedeztük fel a Streptomyces werraensis MK493-CF1 törzsből, és megállapítottuk a teljes szintézisfolyamatot. Biológiai aktivitási vizsgálatokon keresztül felfedeztük, hogy az urs-monoaminsav az urs-monoamid szintetikus köztiterméke, és potenciális...növényi növekedésgátlóEzenkívül különféle urbenonsav-származékokat fejlesztettünk ki, beleértve az urbeniloxi-származékot (UDA), amely magas herbicid aktivitással rendelkezik anélkül, hogy negatívan befolyásolná a HeLa sejtek növekedését. Azt is megállapítottuk, hogy az urmotonsav-származékok megzavarják a növényi mikrotubulusokat; továbbá a KAND hatással van az aktin filamentumokra és sejthalált indukál; Ezek a sokrétű hatások eltérnek az ismert mikrotubulus-gátlók hatásaitól, és az ursonsav új hatásmechanizmusára utalnak, ami fontos előnyt jelent az új herbicidek fejlesztésében.
A jótékony hatású természetes termékek és származékaik felfedezése és gyakorlati alkalmazása az emberi életminőség javításának egyik eszköze. A mikroorganizmusok, növények és rovarok által termelt másodlagos metabolitok jelentős előrelépésekhez vezettek az orvostudományban és a mezőgazdaságban. Számos antibiotikumot és leukémia elleni gyógyszert fejlesztettek ki természetes termékekből. Ezenkívül különféle típusú...növényvédő szerek, gombaölő és herbicideket vonnak ki ezekből a természetes termékekből mezőgazdasági felhasználásra. Különösen a gyomirtó herbicidek fontos eszközök a terméshozamok növelésére a modern mezőgazdaságban, és különféle vegyületeket már kereskedelmi forgalomban is használnak. A növényekben zajló számos sejtfolyamat, mint például a fotoszintézis, az aminosav-anyagcsere, a sejtfalszintézis, a mitózis szabályozása, a fitohormon-jelátvitel vagy a fehérjeszintézis, a herbicidek tipikus célpontjainak tekinthető. A mikrotubulusok működését gátló vegyületek a herbicidek gyakori osztályát alkotják, amelyek a mitózis szabályozásának befolyásolásával befolyásolják a növények növekedését.
A mikrotubulusok a citoszkeleton alkotóelemei, és az eukarióta sejtekben széles körben konzerváltak. A tubulin heterodimer α-tubulinból és β-tubulinból áll, amelyek lineáris mikrotubulus protofilamentumokat alkotnak, 13 protofilamenttel, amelyek hengeres szerkezetet alkotnak. A mikrotubulusok több szerepet játszanak a növényi sejtekben, beleértve a sejt alakjának meghatározását, a sejtosztódást és az intracelluláris transzportot3,4. A növényi sejtek mikrotubulusokat tartalmaznak az interfázisos plazmamembrán alatt, és ezek az úgynevezett kérgi mikrotubulusok feltehetően a cellulóz mikrofibrillumok szerveződését szabályozzák a cellulóz szintáz komplexek szabályozásán keresztül4,5. A gyökér epidermális sejtjeinek kérgi mikrotubulusai, amelyek a gyökércsúcs gyors megnyúlásának zónájában találhatók, laterálisan helyezkednek el, és a cellulóz mikroszálak követik ezeket a mikrotubulusokat, és korlátozzák a sejtek terjeszkedésének irányát, ezáltal elősegítve az anizotrop sejtek megnyúlását. Ezért a mikrotubulusok funkciója szorosan összefügg a növény morfológiájával. A tubulint kódoló génekben az aminosav-helyettesítések a kérgi mikrotubulus-tömbök ferdeségét és bal vagy jobb oldali növekedést okoznak az Arabidopsisban 6,7. Hasonlóképpen, a mikrotubulusokhoz kapcsolódó, a mikrotubulusok dinamikáját szabályozó fehérjék mutációi szintén torz gyökérnövekedéshez vezethetnek8,9,10,11,12,13. Ezenkívül a mikrotubulusokat károsító herbicidekkel, például a dizopiramiddal, más néven pretilaklórral történő kezelés szintén bal oldali ferde gyökérnövekedést okoz14. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mikrotubulusok működésének pontos szabályozása kritikus fontosságú a növény növekedési irányának meghatározásában.
Különböző típusú mikrotubulus-gátlókat fedeztek fel, és ezek a gyógyszerek jelentős mértékben hozzájárultak a citoszkeleton-kutatáshoz, valamint a mezőgazdasághoz és az orvostudományhoz2. Különösen az orizalin, a dinitroanilin vegyületek, a disopiramid, a benzamiddal rokon vegyületek és analógjaik gátolhatják a mikrotubulusok működését, és ezáltal a növények növekedését. Ezért széles körben használják őket herbicidként. Mivel azonban a mikrotubulusok fontos alkotóelemei a növényi és állati sejteknek, a legtöbb mikrotubulus-gátló mindkét sejttípusra citotoxikus. Ezért, annak ellenére, hogy elismert herbicidként hasznosak, gyakorlati célokra korlátozott számú antimikrotubulus szert alkalmaznak.
A Streptomyces a Streptomyces család egyik nemzetsége, amely aerob, Gram-pozitív, fonalas baktériumokat foglal magában, és széles körben ismert arról a képességéről, hogy sokféle másodlagos metabolitot képes előállítani. Ezért az új, biológiailag aktív természetes termékek egyik legfontosabb forrásának tekintik. Jelen tanulmányunkban egy új vegyületet, a kumamoamidot fedeztük fel, amelyet a Streptomyces werraensis MK493-CF1 és az S. werraensis ISP 5486 törzsekből izoláltunk. Spektrális analízis és teljes spektrális analízis segítségével jellemeztük a kumamoamid szerkezetét, és meghatároztuk egyedi N-alkoxi-pirrol vázát. szintézise. Az ursmonsav, az ursmonoamid és származékainak szintetikus köztiterméke, gátolja a népszerű modellnövény, az Arabidopsis thaliana növekedését és csírázását. Egy szerkezet-aktivitás összefüggés vizsgálatban azt találtuk, hogy egy urzonsavvá módosított C9 vegyület, az urzonsav noniloxi-származéka (KAND), jelentősen fokozza a növekedésre és csírázásra gyakorolt gátló hatást. Figyelemre méltó, hogy az újonnan felfedezett növényi növekedésgátló a dohány és a májmoha növekedését is befolyásolta, és nem volt citotoxikus a baktériumokra vagy a HeLa sejtekre. Ezenkívül egyes urmotonsav-származékok torzított gyökérfenotípust indukálnak, ami arra utal, hogy ezek a származékok közvetlenül vagy közvetve befolyásolják a mikrotubulusokat. Ezzel az elképzeléssel összhangban az immunhisztokémiailag vagy fluoreszcens fehérjékkel jelölt mikrotubulusokkal végzett megfigyeléseink azt mutatják, hogy a KAND-kezelés depolimerizálja a mikrotubulusokat. Ezenkívül a kumamotonsav-származékokkal végzett kezelés szétroncsolta az aktin mikrofilamentumokat. Így felfedeztünk egy új növényi növekedésgátlót, amelynek egyedi hatásmechanizmusa a citoszkeleton elpusztítása.
Az MK493-CF1 törzset Tokió Shinagawa-ku kerületében, talajból izolálták. Az MK493-CF1 törzs jól elágazó stromális micéliumot alkotott. Meghatározták a 16S riboszomális RNS gén részleges szekvenciáját (1422 bp). Ez a törzs nagyon hasonlít az S. werraensis-hez (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipikus törzs, 99,93%). Ezen eredmény alapján megállapították, hogy ez a törzs szoros rokonságban áll az S. werraensis típustörzsével. Ezért ideiglenesen az S. werraensis MK493-CF1 törzset neveztük el. Az S. werraensis ISP 5486T szintén ugyanazokat a bioaktív vegyületeket termeli. Mivel korai kutatások történtek a természetes termékek kinyerésével kapcsolatban ebből a mikroorganizmusból, további kémiai kutatásokat végeztek. Az S. werraensis MK493-CF1 törzset árpa táptalajon, szilárd fázisú fermentációval, 30°C-on 14 napig tenyésztettük, majd a táptalajon 50%-os etanollal extraháltuk. A mintát 60 ml-rel szárítottuk, így 59,5 mg nyers kivonatot kaptunk. A nyers kivonatot fordított fázisú HPLC-nek vetettük alá, így N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamidot (1, elnevezve kumamonamid, 36,0 mg) kaptunk. Az 1 teljes mennyisége a nyers kivonat körülbelül 60%-a. Ezért úgy döntöttünk, hogy részletesen megvizsgáljuk a kumamotoamid 1 tulajdonságait.
A kumamonamid 1 egy fehér amorf por, és a nagy felbontású tömegspektrometria (HRESIMS) megerősíti a C6H8N2O2 jelenlétét (1. ábra). A vegyület C2-szubsztituált pirrol fragmentumát a következő jellemzi: δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH az 1H NMR spektrumban: 4,5 Hz, H-5) és δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), és a 13C NMR spektrum négy sp2 szénatom jelenlétét mutatja. A C2 pozícióban lévő amidcsoport jelenlétét HMBC korrelációval értékelték a C-3 protontól az amid karbonil szénatomjáig δC 161,1 értéknél. Ezenkívül az 1H és 13C NMR csúcsok δH 4,10 (3H, S) és δC 68,3 értékeknél az N-metoxicsoportok jelenlétét jelzik a molekulában. Bár a metoxicsoport helyes helyzetét spektroszkópiai analízissel, például fokozott differencia spektroszkópiával és nukleáris Overhauser-rövidítéssel (NOEDF) még nem határozták meg, az N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamid lett az első vegyületjelölt.
Az 1-es vegyület helyes szerkezetének meghatározásához teljes szintézist végeztünk (2a. ábra). A kereskedelmi forgalomban kapható 2-aminopiridin 2 m-CPBA-val történő kezelése kvantitatív hozammal eredményezte a megfelelő 3-as N-oxidot. A 2-es vegyület 2-aminoazidálása után az Abramovich által leírt ciklokondenzációs reakciót benzolban, 90°C-on hajtottuk végre, így kaptuk a kívánt 1-hidroxi-1H-pirrol-2-karbonitrilt 5 grammban. Sebesség 60% (két lépés). 15,16. A 4-es vegyület metilezése és hidrolízise ezután jó hozammal (70%, két lépés) eredményezte az 1-metoxi-1H-pirrol-2-karbonsavat (más néven „kumotonsav”, 6). Végül a 6-os savkloridos köztiterméken keresztüli amidálás vizes ammóniával 98%-os hozammal eredményezte az 1-es Kumamoto-amidot. A szintetizált 1-es vegyület összes spektrális adata hasonló volt az izolált 1-es vegyületéhez, így az 1-es vegyület szerkezetét meghatároztuk;
Az urbenamid és az urbénsav általános szintézise és biológiai aktivitásának elemzése. (a) Kumamoto-amid teljes szintézise. (b) Hétnapos vad típusú Arabidopsis Columbia (Col) palántákat neveltünk Murashige és Skoog (MS) lemezeken, amelyek a megadott koncentrációban tartalmaztak kumamonamid 6-ot vagy kumamonamid 1-et. Lépték = 1 cm.
Először az urbenamid és intermedierjeinek biológiai aktivitását vizsgáltuk a növénynövekedést moduláló képességük szempontjából. Különböző koncentrációjú ursmonamid 1-et vagy ursmonsavat 6-ot adtunk MS agar táptalajhoz, és Arabidopsis thaliana palántákat tenyésztettünk ezen a táptalajon. Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a 6-os vegyület nagy koncentrációja (500 μM) gátolta a gyökérnövekedést (2b. ábra). Ezután a 6-os vegyület N1 pozíciójának helyettesítésével különböző származékokat állítottunk elő, és szerkezet-aktivitás összefüggési vizsgálatokat végeztünk rajtuk (az analóg szintézis folyamatát a Kiegészítő Információkban (SI) ismertetjük). Az Arabidopsis palántákat 50 μM urzonsav-származékokat tartalmazó táptalajon növesztettük, és a gyökérhosszt megmértük, ahogy az a képen látható. Amint a 3a., b. és S1. ábrákon látható, a kumamosavak különböző hosszúságú lineáris alkoxiláncokkal (9, 10, 11, 12 és 13) vagy nagy alkoxiláncokkal (15, 16 és 17) rendelkeznek az N1 pozícióban. A származékok jelentős gyökérnövekedés-gátlást mutattak. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a 200 μM 10, 11 vagy 17 alkalmazása gátolta a csírázást (3c. és S2. ábra).
A Kumamoto-amid és rokon vegyületek szerkezet-aktivitás összefüggésének vizsgálata. (a) Az analógok szerkezete és szintézisvázlata. (b) 7 napos palánták gyökérhosszának mennyiségi meghatározása MS táptalajon, 50 μM kumamonamid-származékokkal vagy anélkül. A csillagok a kontrollkezeléshez képest szignifikáns különbségeket jelzik (t-próba, p-érték).< 0,05). n>18. Az adatokat átlag ± SD formátumban adjuk meg. Az nt azt jelenti, hogy „nem tesztelték”, mivel a magok több mint 50%-a nem csírázott. (c) A kezelt magok csírázási arányának számszerűsítése, amelyeket 7 napig MS táptalajban inkubáltunk 200 μM kumamonamiddal és rokon vegyületekkel vagy anélkül. A csillagok a kontrollcsoporthoz képest szignifikáns különbségeket jelzik (khi-négyzet próba). n=96.
Érdekes módon a C9-nél hosszabb alkil oldalláncok hozzáadása csökkentette a gátló aktivitást, ami arra utal, hogy a kumamotoinsavval rokon vegyületeknek bizonyos méretű oldalláncokra van szükségük a biológiai aktivitásuk kifejtéséhez.
Mivel a szerkezet-aktivitás összefüggés elemzés kimutatta, hogy a C9 urzonsavvá módosult, és az urzonsav noniloxi-származéka (a továbbiakban KAND 11) volt a leghatékonyabb növényi növekedésgátló, részletesebb KAND 11 jellemzést végeztünk. Az Arabidopsis 50 μM KAND 11-gyel történő kezelése szinte teljesen megakadályozta a csírázást, míg a KAND 11 alacsonyabb koncentrációi (40, 30, 20 vagy 10 μM) dózisfüggő módon gátolták a gyökérnövekedést (4a., b. ábra). Annak tesztelésére, hogy a KAND 11 befolyásolja-e a gyökérmerisztéma életképességét, propidium-jodiddal (PI) festett gyökérmerisztémákat vizsgáltunk, és megmértük a merisztéma területét. A 25 μM KAND-11-et tartalmazó táptalajon nevelt palánták merisztémájának mérete 151,1 ± 32,5 μm volt, míg a DMSO-t tartalmazó kontroll táptalajon nevelt palánták merisztémájának mérete 264,7 ± 30,8 μm volt (4c., d. ábra), ami arra utal, hogy a KAND-11 helyreállítja a sejtek aktivitását. Gyökérmerisztéma. Ezzel összhangban a KAND 11 kezelés csökkentette a CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sejtosztódási marker mennyiségét a gyökérmerisztémában (4e. ábra) 17. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a KAND 11 gátolja a gyökérnövekedést a sejtek proliferációs aktivitásának csökkentésével.
Az urbenonsav-származékok (urbeniloxi-származékok) növekedésgátló hatásának elemzése. (a) 7 napos vad típusú Col palánták, MS lemezeken nevelve a jelzett KAND 11 koncentrációkkal. Lépték = 1 cm. (b) A gyökérhossz számszerűsítése. A betűk a szignifikáns különbségeket jelzik (Tukey HSD teszt, p< 0,05). n>16. Az adatokat átlag ± SD alakban mutatjuk be. (c) Propidium-jodiddal festett vad típusú Col gyökerek konfokális mikroszkópiája, MS lemezeken 25 μM KAND 11-gyel vagy anélkül. A fehér zárójelek a gyökérmerisztémát jelzik. Skála = 100 µm. (d) A gyökérmerisztéma méretének számszerűsítése (n = 10-11). A statisztikai különbségeket t-próbával határoztuk meg (p< 0,05). Az oszlopok az átlagos merisztémaméretet jelölik. (e) A CDKB2 konstrukciót tartalmazó gyökérmerisztéma differenciális interferencia kontraszt (DIC) mikroszkópiája; 1pro: CDKB2; 1-GUS festés és festés MS lemezeken nevelt 5 napos palántákon 25 µM KAND assay-vel vagy anélkül.
A KAND 11 fitotoxicitását egy másik kétszikű növénnyel, a dohánynal (Nicotiana tabacum), és egy jelentős szárazföldi növénymodellorganizmussal, a májmohával (Marchantia polymorpha) is tesztelték. Az Arabidopsishoz hasonlóan a 25 μM KAND 11-et tartalmazó táptalajon nevelt dohány SR-1 palánták rövidebb gyökereket hoztak (5a. ábra). Ezenkívül a 48 magból 40 csírázott 200 μM KAND 11-et tartalmazó lemezeken, míg mind a 48 mag csírázott kontrollként kezelt táptalajon, ami arra utal, hogy a magasabb KAND-koncentrációk szignifikánsak voltak (p< 0,05; chi-próba - négyzet) gátolta a dohány csírázását. (5b. ábra). Ezenkívül a KAND 11 koncentrációja, amely gátolta a baktériumok növekedését a májmohában, hasonló volt az Arabidopsisban hatékony koncentrációhoz (5c. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a KAND 11 gátolhatja számos növény növekedését. Ezután megvizsgáltuk a medvemonoamiddal rokon vegyületek lehetséges citotoxicitását más organizmusokban, nevezetesen emberi HeLa sejtekben és az Escherichia coli DH5α törzsben, amelyek a magasabb rendű állati, illetve baktériumsejtek képviselői. Egy sor sejtszaporodási vizsgálatban megfigyeltük, hogy a kumamonamid 1, a kumamonamidsav 6 és a KAND 11 nem befolyásolta a HeLa vagy az E. coli sejtek növekedését 100 μM koncentrációban (5d., e. ábra).
A KAND 11 növekedésgátlása nem Arabidopsis organizmusokban. (a) Kéthetes vad típusú SR-1 dohánypalántákat neveltünk függőlegesen elhelyezett, 25 μM KAND 11-et tartalmazó MS lemezeken. (b) Kéthetes vad típusú SR-1 dohánypalántákat neveltünk vízszintesen elhelyezett, 200 μM KAND 11-et tartalmazó MS lemezeken. (c) Kéthetes vad típusú Tak-1 májmoha rügyeket neveltünk Gamborg B5 lemezeken a feltüntetett KAND 11 koncentrációkkal. A piros nyilak azokat a spórákat jelzik, amelyek növekedése a kéthetes inkubációs időszakon belül leállt. (d) HeLa sejtek proliferációs vizsgálata. Az életképes sejtek számát rögzített időközönként mértük egy 8-as sejtszámláló készlet (Dojindo) segítségével. Kontrollként a HeLa sejteket 5 μg/ml aktinomicin D-vel (Act D) kezeltük, amely gátolja az RNS polimeráz transzkripcióját és sejthalált okoz. Az elemzéseket háromszor végeztük. (e) E. coli sejtproliferációs vizsgálat. Az E. coli növekedését OD600 mérésével elemeztük. Kontrollként a sejteket 50 μg/ml ampicillinnel (Amp) kezeltük, amely gátolja a bakteriális sejtfal szintézisét. Az elemzéseket háromszor végeztük.
Az uramiddal rokon vegyületek által okozott citotoxicitás hatásmechanizmusának megfejtéséhez újra elemeztük a mérsékelt gátló hatású urbénsav-származékokat, amint az a képen is látható. Amint a 2b. és 6a. ábrákon látható, a nagy koncentrációjú (200 μM) urmotonsavat 6 tartalmazó agarlemezeken nevelt palánták rövidebb és balra görbült gyökereket hoztak (θ = –23,7 ± 6,1), míg a kontroll táptalajon nevelt palánták szinte egyenes gyökereket hoztak (θ = –3,8 ± 7,1). Ismert, hogy ez a jellegzetes ferde növekedés a kérgi mikrotubulusok diszfunkciójának eredménye14,18. Ezzel a megállapítással összhangban a mikrotubulusokat destabilizáló dizopiramid és orizalin gyógyszerek hasonló gyökérdőlést indukáltak növekedési körülményeink között (2b. és 6a. ábra). Ugyanakkor teszteltük az urmotonsav-származékokat, és kiválasztottunk közülük többet, amelyek bizonyos koncentrációkban ferde gyökérnövekedést indukáltak. A 8-as, 9-es és 15-ös vegyületek megváltoztatták a gyökérnövekedés irányát 75 μM, 50 μM és 40 μM koncentrációban, ami azt jelzi, hogy ezek a vegyületek hatékonyan destabilizálják a mikrotubulusokat (2b., 6a. ábra). A legerősebb ursolsav-származékot, a KAND 11-et alacsonyabb koncentrációban (15 µM) is teszteltük, és azt tapasztaltuk, hogy a KAND 11 alkalmazása gátolja a gyökérnövekedést, és a gyökérnövekedés iránya egyenetlen, bár hajlamosak balra dőlni (C3. ábra). Mivel a mikrotubulusokat destabilizáló gyógyszerek magasabb koncentrációi néha inkább gátolják a növény növekedését, mintsem a gyökér dőlését okoznák, ezt követően megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy a KAND 11 hatással van a mikrotubulusokra, a gyökér epidermális sejtjeiben található kérgi mikrotubulusok megfigyelésével. A 25 μM KAND 11-gyel kezelt palántagyökerek epidermális sejtjeiben anti-β-tubulin antitesteket alkalmazó immunhisztokémia szinte az összes kérgi mikrotubulus eltűnését mutatta ki az epidermális sejtekben a megnyúlási zónában (6b. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a kumamotonsav és származékai közvetlenül vagy közvetve hatnak a mikrotubulusokra, károsítva azokat, és hogy ezek a vegyületek új mikrotubulus-gátlók.
Az urzonsav és származékai megváltoztatják az Arabidopsis thaliana kérgi mikrotubulusait. (a) A gyökér hajlásszöge különböző urmotonsav-származékok jelenlétében mérve a megadott koncentrációkban. Két, a mikrotubulusokat gátló ismert vegyület, a dizopiramid és az orizalin hatását is elemezték. A betét a gyökérnövekedési szög mérésére használt standardot mutatja. A csillagok a kontrollkezeléshez képest szignifikáns különbségeket jelölnek (t-próba, p-érték).< 0,05). n>19. Lépték = 1 cm. (b) Kérgi mikrotubulusok az epidermális sejtekben az elongációs zónában. A vad típusú Arabidopsis Col gyökerekben lévő, MS lemezeken 25 μM KAND 11-gyel vagy anélkül növesztett mikrotubulusokat β-tubulin primer antitestek és Alexa Fluor-konjugált szekunder antitestek alkalmazásával immunhisztokémiai festéssel vizualizáltuk. Lépték = 10 µm. (c) A mikrotubulusok mitotikus szerkezete a gyökérmerisztémában. A mikrotubulusokat immunhisztokémiai festéssel vizualizáltuk. A mitotikus szerkezeteket, beleértve a profázis zónákat, orsókat és fragmoplasztokat, konfokális képekből számoltuk. A nyilak a mitotikus mikrotubulus szerkezeteket jelzik. A csillagok a kontrollcsoporthoz képest szignifikáns különbségeket jelzik (t-próba, p-érték).< 0,05). n>9. Lépték = 50 µm.
Bár az ursa képes megzavarni a mikrotubulusok működését, hatásmechanizmusa várhatóan eltér a tipikus mikrotubulus depolimerizáló szerekétől. Például a mikrotubulus depolimerizáló szerek, mint például a dizopiramid és az orizalin, magasabb koncentrációban az epidermális sejtek anizotrop terjeszkedését idézik elő, míg a KAND 11 nem. Ezenkívül a KAND 11 és a dizopiramid együttes alkalmazása a dizopiramid által kiváltott kombinált gyökérnövekedési választ eredményezett, és a KAND 11 által kiváltott növekedésgátlást figyeltek meg (S4. ábra). Elemeztük a hiperérzékeny dizopiramid 1-1 (phs1-1) mutáns KAND 11-re adott válaszát is. A phs1-1 nem kanonikus tubulin-kináz pontmutációval rendelkezik, és rövidebb gyökereket hoz létre, ha dizopiramiddal kezelik9,20. A KAND 11-et tartalmazó agar táptalajon nevelt phs1-1 mutáns palánták rövidebb gyökerekkel rendelkeztek, hasonlóan a dizopiramidon neveltekhez (S5. ábra).
Ezenkívül mitotikus mikrotubulus-struktúrákat, például profáziszónákat, orsókat és fragmoplasztokat figyeltünk meg a KAND 11-gyel kezelt palánták gyökérmerisztémájában. A CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS megfigyeléseivel összhangban a mitotikus mikrotubulusok számának jelentős csökkenését figyeltük meg (6c. ábra).
A KAND 11 citotoxicitásának szubcelluláris felbontásban történő jellemzésére dohány BY-2 szuszpenziós sejteket KAND 11-gyel kezeltünk, és megfigyeltük a válaszukat. Először KAND 11-et adtunk a mikrotubulusokat fluoreszcensen jelző TagRFP-TUA6-ot expresszáló BY-2 sejtekhez, hogy felmérjük a KAND 11 hatását a kérgi mikrotubulusokra. A kérgi mikrotubulusok sűrűségét képelemzéssel értékeltük, amely számszerűsítette a citoszkeletális pixelek százalékos arányát a citoplazmatikus pixelek között. A vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy 50 μM vagy 100 μM KAND 11-gyel 1 órán át történő kezelés után a sűrűség szignifikánsan 0,94 ± 0,74%-ra, illetve 0,23 ± 0,28%-ra csökkent, míg a DMSO-val kezelt sejtek sűrűsége 1,61 ± 0,34%-ot tett ki (7a. ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak az Arabidopsisban megfigyelttel, miszerint a KAND 11 kezelés a kérgi mikrotubulusok depolimerizációját indukálja (6b. ábra). Megvizsgáltuk a BY-2 sejtvonalat GFP-ABD-vel jelölt aktin filamentumokkal is, azonos koncentrációjú KAND 11-gyel történő kezelés után, és megfigyeltük, hogy a KAND 11 kezelés szétroncsolta az aktin filamentumokat. Az 50 μM vagy 100 μM KAND 11-gyel 1 órán át végzett kezelés szignifikánsan csökkentette az aktin filamentum sűrűségét 1,20 ± 0,62%-ra, illetve 0,61 ± 0,26%-ra, míg a DMSO-val kezelt sejtekben a sűrűség 1,69 ± 0,51% volt (2. ábra). 7b). Ezek az eredmények ellentétben állnak a propizamid, amely nem befolyásolja az aktin filamentumokat, és a latrunkulin B, egy mikrotubulusokat nem befolyásoló aktin depolimerizáló hatásával (S6. ábra). Ezenkívül a kumamonamid 1-gyel, a kumamonamid sav 6-tal vagy a KAND 11-gyel történő kezelés nem befolyásolta a mikrotubulusokat a HeLa sejtekben (S7. ábra). Így feltételezhető, hogy a KAND 11 hatásmechanizmusa eltér az ismert citoszkeleton-károsítóktól. Ezenkívül a KAND 11-gyel kezelt BY-2 sejtek mikroszkópos megfigyelése kimutatta a sejthalál kezdetét a KAND 11 kezelés során, és kimutatta, hogy az Evans-kékre festett elhalt sejtek aránya nem nőtt szignifikánsan a KAND 11 30 perces kezelés után, míg 90 perces 50 μM vagy 100 μM KAND-dal történő kezelés után az elhalt sejtek száma 43,7%-ra, illetve 80,1%-ra nőtt (7c. ábra). Összefoglalva, ezek az adatok azt jelzik, hogy az új urzolsav-származék, a KAND 11 egy növényspecifikus citoszkeleton-gátló, amelynek hatásmechanizmusa korábban ismeretlen.
A KAND hatással van a dohány BY-2 sejtek kérgi mikrotubulusaira, aktin filamentumaira és életképességére. (a) Kérgi mikrotubulusok vizualizációja BY-2 sejtekben TagRFP-TUA6 jelenlétében. A KAND 11-gyel (50 μM vagy 100 μM) vagy DMSO-val kezelt BY-2 sejteket konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. A kérgi mikrotubulus-sűrűséget 25 független sejt mikroszkópos felvételeiből számítottuk ki. A betűk a szignifikáns különbségeket jelzik (Tukey HSD teszt, p< 0,05). Lépték = 10 µm. (b) A BY-2 sejtek kérgi aktin filamentumai, GFP-ABD2 jelenlétében vizualizálva. A KAND 11-gyel (50 μM vagy 100 μM) vagy DMSO-val kezelt BY-2 sejteket konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. A kérgi aktin filamentumok sűrűségét 25 független sejt mikroszkópos felvételeiből számítottuk ki. A betűk a szignifikáns különbségeket jelzik (Tukey HSD teszt, p< 0,05). Lépték = 10 µm. (c) Elpusztult BY-2 sejtek vizsgálata Evans-kék festéssel. A KAND 11-gyel (50 μM vagy 100 μM) vagy DMSO-val kezelt BY-2 sejteket világos látóterű mikroszkóppal vizsgáltuk. n=3. Lépték = 100 µm.
Az új természetes termékek felfedezése és alkalmazása jelentős előrelépésekhez vezetett az emberi élet különböző területein, beleértve az orvostudományt és a mezőgazdaságot is. Történeti kutatásokat végeztek hasznos vegyületek kinyerésére a természeti erőforrásokból. Különösen az aktinomicéták ismertek arról, hogy hasznos parazitaellenes antibiotikumok a fonálférgek ellen, mivel képesek különféle másodlagos metabolitokat, például avermektint, az ivermektin vezető vegyületét, valamint a bleomicint és származékait termelni, amelyeket gyógyászatilag rákellenes szerként használnak21,22. Hasonlóképpen, számos herbicid vegyületet fedeztek fel az aktinomicétákból, amelyek közül néhányat már kereskedelmi forgalomban is használnak1,23. Ezért az aktinomicéta metabolitjainak elemzése a kívánt biológiai aktivitással rendelkező természetes termékek izolálása érdekében hatékony stratégiának tekinthető. Ebben a tanulmányban egy új vegyületet, a kumamonamidot fedeztük fel az S. werraensisből, és sikeresen szintetizáltuk. Az urzonsav az urbenamid és származékai szintetikus köztiterméke. Jellegzetes gyökérgöndörödést okozhat, közepes vagy erős herbicid aktivitást mutathat, és közvetlenül vagy közvetve károsíthatja a növények mikrotubulusait. Az urmotonsav hatásmechanizmusa azonban eltérhet a meglévő mikrotubulus-gátlókétól, mivel a KAND 11 szintén károsítja az aktin filamentumokat és sejthalált okoz, ami egy olyan szabályozó mechanizmusra utal, amelyen keresztül az urmotonsav és származékai a citoszkeleton struktúrák széles skáláját befolyásolják.
Az urbenonsav további részletes jellemzése segít jobban megérteni az urbenonsav hatásmechanizmusát. A következő cél különösen az urzonsav redukált mikrotubulusokhoz való kötődési képességének értékelése annak meghatározása érdekében, hogy az urzonsav és származékai közvetlenül hatnak-e a mikrotubulusokra és depolimerizálják-e azokat, vagy hatásuk a mikrotubulusok destabilizálódásához vezet. Ezenkívül abban az esetben, ha a mikrotubulusok nem közvetlen célpontok, az urzonsav növényi sejteken kifejtett hatáshelyének és molekuláris célpontjainak azonosítása segít jobban megérteni a rokon vegyületek tulajdonságait és a herbicid aktivitás javításának lehetséges módjait. Bioaktivitási vizsgálatunk feltárta az urzonsav egyedülálló citotoxikus képességét olyan növények növekedésére, mint az Arabidopsis thaliana, a dohány és a májmoha, míg sem az E. coli, sem a HeLa sejteket nem érintette. Az állati sejtekre gyakorolt csekély vagy semmilyen toxicitás az urzonsav-származékok előnye, ha nyílt mezőgazdasági területeken való alkalmazásra szánt herbicidként fejlesztik őket. Valójában, mivel a mikrotubulusok gyakori struktúrák az eukariótákban, szelektív gátlásuk a növényekben kulcsfontosságú követelmény a herbicidek esetében. Például a propizamid, egy mikrotubulus-depolimerizáló szer, amely közvetlenül kötődik a tubulinhoz és gátolja a polimerizációt, gyomirtó szerként használatos, mivel alacsony toxicitást mutat az állati sejtekkel szemben24. A diszopiramiddal ellentétben a rokon benzamidok eltérő célspecificitással rendelkeznek. A növényi mikrotubulusok mellett az RH-4032 vagy a benzoxamid az állati sejtek, illetve az oomiceták mikrotubulusait is gátolja, a zalilamidot pedig alacsony fitotoxicitása miatt gombaölő szerként használják25,26,27. Az újonnan felfedezett medvegomba és származékai szelektív citotoxicitást mutatnak a növényekkel szemben, de érdemes megjegyezni, hogy további módosítások megváltoztathatják célspecificitásukat, potenciálisan további származékokat biztosítva a kórokozó gombák vagy oomiceták elleni védekezéshez.
Az urbenonsav és származékai egyedi tulajdonságai hasznosak herbicidként való fejlesztésükhöz és kutatási eszközként való felhasználásukhoz. A citoszkeleton fontossága a növényi sejtek alakjának szabályozásában széles körben elismert. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a növények a mikrotubulusok dinamikájának szabályozásával komplex kérgi mikrotubulus-szerveződési mechanizmusokat fejlesztettek ki a morfogenezis megfelelő szabályozása érdekében. Számos, a mikrotubulusok aktivitásának szabályozásáért felelős molekulát azonosítottak, és a kapcsolódó kutatások még mindig folyamatban vannak3,4,28. A növényi sejtek mikrotubulus-dinamikájáról alkotott jelenlegi ismereteink nem magyarázzák meg teljesen a kérgi mikrotubulusok szerveződésének mechanizmusait. Például, bár mind a dizopiramid, mind az orizalin képes depolimerizálni a mikrotubulusokat, a dizopiramid súlyos gyökértorzulást okoz, míg az orizalinnak viszonylag enyhe hatása van. Ezenkívül a mikrotubulusokat stabilizáló tubulin mutációi a gyökerekben is jobbra forgást okoznak, míg a paklitaxel, amely szintén stabilizálja a mikrotubulusok dinamikáját, nem. Ezért az ursolsav molekuláris célpontjainak vizsgálata és azonosítása új ismereteket nyújthat a növényi kérgi mikrotubulusok szabályozásába. Hasonlóképpen, a torz növekedést elősegítő hatékony vegyi anyagok, mint például a dizopiramid, és a kevésbé hatékony vegyi anyagok, mint például az orizalin vagy a kumamotorsav jövőbeli összehasonlítása nyomokat adhat arra vonatkozóan, hogyan történik a torz növekedés.
Másrészt a védekezéssel kapcsolatos citoszkeleton-átrendeződések egy másik lehetőséget jelentenek az ursonsav citotoxicitásának magyarázatára. Egy kórokozó fertőzése vagy egy elicitor bejuttatása a növényi sejtekbe néha a citoszkeleton pusztulását és az azt követő sejthalált okozza29. Például az oomikétákból származó kriptoxantinról kimutatták, hogy a dohánysejtek halála előtt károsítja a mikrotubulusokat és az aktin filamentumokat, hasonlóan ahhoz, ami a KAND-kezelés során történik30,31. A védekező válaszok és az ursonsav által kiváltott sejtes válaszok közötti hasonlóságok arra a hipotézisre vezettek minket, hogy ezek közös sejtes folyamatokat indítanak el, bár az ursonsav gyorsabb és erősebb hatása nyilvánvaló, mint a kriptoxantiné. Tanulmányok azonban kimutatták, hogy az aktin filamentumok károsítása elősegíti a spontán sejthalált, amelyet nem mindig kísér a mikrotubulusok károsítása29. Ezenkívül még nem tisztázott, hogy a kórokozó vagy az elicitor okoz-e torz gyökérnövekedést, ahogyan az ursonsav-származékok. Így a védekező válaszok és a citoszkeleton összekapcsolására vonatkozó molekuláris ismeretek vonzó problémát jelentenek. Az urzonsavhoz kapcsolódó kis molekulatömegű vegyületek, valamint a különböző hatékonyságú származékok jelenlétének kihasználásával lehetőséget kínálhatnak ismeretlen sejtmechanizmusok célba vételére.
Összefoglalva, a mikrotubulusok dinamikáját moduláló új vegyületek felfedezése és alkalmazása hatékony módszereket kínál majd a növényi sejtek alakjának meghatározása mögött meghúzódó komplex molekuláris mechanizmusok kezelésére. Ebben az összefüggésben a nemrégiben kifejlesztett urmotonsav vegyület, amely a mikrotubulusokra és az aktin filamentumokra hat, és sejthalált indukál, lehetőséget adhat a mikrotubulusok szabályozása és ezen egyéb mechanizmusok közötti kapcsolat megfejtésére. Így az urbenonsavat alkalmazó kémiai és biológiai elemzés segít megérteni a növényi citoszkeletont szabályozó molekuláris szabályozó mechanizmusokat.
Oltsunk be S. werraensis MK493-CF1 törzset egy 500 ml-es, terelőlapos Erlenmeyer-lombikba, amely 110 ml oltóközeget tartalmaz, amely 2% (t/t) galaktózból, 2% (t/t) Essence pasztából, 1% (t/t) Bacto összetételű -soytonból (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (t/t) kukoricakivonatból (KOGOSTCH Co., Ltd., Japán), 0,2% (t/t) (NH4)2SO4-ből és 0,2% CaCO3-ból áll ioncserélt vízben (pH 7,4 sterilizálás előtt). Az oltókultúrákat forgó rázógépen (180 fordulat/perc) inkubáltuk 27°C-on 2 napig. Termelési tenyésztés szilárd fázisú fermentációval. Az oltótenyészetet (7 ml) egy 500 ml-es K-1 lombikba vittük át, amely 40 g termelési táptalajt tartalmazott, amely 15 g préselt árpából (MUSO Co., Ltd., Japán) és 25 g ioncserélt vízből (a pH-t sterilizálás előtt nem állítottuk be) állt. A fermentációt 30°C-on, sötétben, 14 napig végeztük. A fermentációs anyagot 40 ml/palack EtOH-val extraháltuk, majd centrifugáltuk (1500 g, 4°C, 10 perc). A tenyészet felülúszóját (60 ml) 10% MeOH/EtOAc eleggyel extraháltuk. A szerves réteget csökkentett nyomáson bepároltuk, így 59,5 mg maradékot kaptunk, amelyet HPLC-nek vetettünk alá gradiens eluálással (0–10 perc: 90%) fordított fázisú oszlopon (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × hossz 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 perc: 90% H2O/CH3CN - 70% H2O/CH3CN (gradiens), 35–45 perc: 90% H2O/EtOH, 45–155 perc: 90% H2O/EtOH - 100% EtOH (gradiens (gradiens), 155–200 perc: 100% EtOH) 1,5 ml/perc áramlási sebességgel. 36,0 mg kumamonamidot (1) izoláltunk fehér amorf por formájában.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ számított érték: 141,0659, mért érték: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
A Columbia magokat (Col-0) az Arabidopsis Biológiai Erőforrás Központtól (ABRC) szereztük be kutatási felhasználási engedéllyel. A Col-0 magokat laboratóriumi körülményeink között szaporítottuk és tartottuk fenn, majd vad típusú Arabidopsis növényekként használtuk. Az Arabidopsis magokat felületileg sterilizáltuk, és félkoncentrációjú Murashige és Skoog táptalajon tenyésztettük, amely 2% szacharózt (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etánszulfonsavat (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) és 1,5% agart (Fujifilm Wako Pure Chemical) tartalmazott, pH 5,7, 23 °C-on, állandó fény mellett. A phs1-1 mutáns magjait T. Hashimoto (Nara Tudományos és Technológiai Intézet) biztosította.
Az SR-1 törzs magjait T. Hashimoto (Nara Tudományos és Technológiai Intézet) biztosította, és vad típusú dohánynövényként használták. A dohánymagokat felületileg sterilizálták, és három éjszakán át steril vízben áztatták a csírázás elősegítése érdekében, majd 2% szacharózt, 0,05% (tömeg/térfogat) MES-t és 0,8% gellángumit (Fujifilm Wako Pure Chemical) (Murashige és Skoog táptalaj) tartalmazó, félkoncentrációjú oldatba helyezték, pH 5,7-es értékkel, és 23°C-on, állandó fény mellett inkubálták.
A Tak-1 törzset T. Kohchi (Kyotói Egyetem) biztosította, és standard kísérleti egységként használták a májmohával végzett vizsgálatban. A Gemmát sterilizált tenyésztett növényekből nyerték, majd Gamborg B5 táptalajra (Fujifilm Wako Pure Chemical) szélesztették, amely 1% szacharózt és 0,3% gellángumit tartalmazott, és 23°C-on, folyamatos fény alatt inkubálták.
A dohány BY-2 sejteket (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokiói Egyetem) biztosította. A BY-2 sejteket 95-szörösére hígítottuk módosított Linsmeier és Skoog táptalajon, és hetente 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavval egészítettük ki. A sejtszuszpenziót forgó rázógépen 130 fordulat/perc sebességgel kevertük 27°C-on, sötétben. A sejteket tízszeres térfogatú friss táptalajon mostuk, majd ugyanebben a táptalajon szuszpendáltuk újra. A karfiol mozaikvírus 35S promóter alatt a TagRFP-TUA6 mikrotubulus markert vagy a GFP-ABD2 aktin filamentum markert stabilan expresszáló BY-2 transzgénikus sejtvonalakat a leírtak szerint állítottuk elő33,34,35. Ezek a sejtvonalak az eredeti BY-2 sejtvonalhoz alkalmazottakhoz hasonló eljárásokkal tarthatók fenn és szinkronizálhatók.
A HeLa sejteket Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (DMEM) (Life Technologies) tenyésztettük, amelyet 10% magzati szarvasmarha-szérummal, 1,2 U/ml penicillinnel és 1,2 μg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki, 37°C-os inkubátorban, 5% CO2-atmoszférában.
A kéziratban leírt összes kísérletet a japán biológiai biztonsági előírásoknak és irányelveknek megfelelően végeztük.
A vegyületeket dimetil-szulfoxidban (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) oldottuk törzsoldatként, és MS táptalajban hígítottuk Arabidopsis és dohány, illetve Gamborg B5 táptalajban májmoha esetén. A gyökérnövekedés-gátlási vizsgálathoz lemezenként több mint 10 magot vetettünk el agar táptalajra, amely a jelzett vegyületeket vagy DMSO-t tartalmazta. A magokat 7 napig inkubáltuk növekedési kamrában. A palántákat lefényképeztük, és megmértük a gyökerek hosszát. Az Arabidopsis csírázási vizsgálathoz lemezenként 48 magot vetettünk el 200 μM vegyületet vagy DMSO-t tartalmazó agar táptalajra. Az Arabidopsis magokat növekedési kamrában növesztettük, és a csírázott palánták számát a csírázás után 7 nappal (dag) megszámoltuk. A dohány csírázási vizsgálatához lemezenként 24 magot vetettünk el 200 μM KAND-ot vagy DMSO-t tartalmazó agar táptalajra. A dohánymagokat növekedési kamrában növesztettük, és a csírázott palánták számát 14 nap elteltével megszámoltuk. A májmoha növekedésgátlási vizsgálatához minden lemezről 9 embriót szélesztettünk agar táptalajra, amely a megadott koncentrációjú KAND-ot vagy DMSO-t tartalmazta, és 14 napig inkubáltuk növekedési kamrában.
A gyökérmerisztéma szerveződésének vizualizálásához 5 mg/ml propidium-jodiddal (PI) festett palántákat használtunk. A PI-jeleket fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg TCS SPE konfokális lézer pásztázó mikroszkóp (Leica Microsystems) segítségével.
A gyökerek hisztokémiai festését β-glükuronidázzal (GUS) Malami és Benfey36 által leírt protokoll szerint végeztük. A palántákat 90%-os acetonban fixáltuk egy éjszakán át, majd 0,5 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-β-d-glükuronsavval, GUS pufferben festettük 1 órán át, és hidratált klóraldehid oldatba (8 g klóralhidrát, 2 ml víz és 1 ml glicerin) helyeztük, és differenciális interferencia kontraszt mikroszkóppal vizsgáltuk Axio Imager M1 mikroszkóp (Carl Zeiss) segítségével.
A gyökérszögeket 7 napos, függőlegesen elhelyezett tányérokon nevelt palántákon mérték. A gyökér szögét a gravitációs vektor irányából mérték a 6. lépésben leírtak szerint.
A kérgi mikrotubulusok elrendeződését a leírtak szerint figyeltük meg, a protokoll kisebb módosításaival37. Elsődleges és másodlagos antitestként β-tubulin elleni antitestet (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) és Alexa Fluor 488-konjugált egér elleni IgG-t (Thermo Fisher Scientific: A32723) használtunk 1:1000, illetve 1:100 hígításban. A fluoreszcencia képeket TCS SPE konfokális lézer pásztázó mikroszkóppal (Leica Microsystems) vettük fel. A Z-stack képeket a gyártó utasításai szerint készítettük el, és maximális intenzitású vetítéseket készítettünk.
A HeLa sejtszaporodási vizsgálatot a Cell Counting Kit 8 (Dojindo) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint.
Az E. coli DH5α növekedését a tenyészet sejtsűrűségének 600 nm-en mért spektrofotométerrel történő mérésével elemeztük (OD600).
A transzgénikus BY-2 sejtek citoszkeleton-szerveződését CSU-X1 konfokális pásztázó eszközzel (Yokogawa) és sCMOS kamerával (Zyla, Andor Technology) felszerelt fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg. A citoszkeleton sűrűségét képelemzéssel értékeltük, amely a konfokális képeken a citoszkeleton pixelek százalékos arányát számszerűsítette ImageJ szoftver segítségével a leírtak szerint38,39.
A BY-2 sejtek sejthalálának kimutatására a sejtszuszpenzió egy alikvot részét 0,05%-os Evans-kékkel inkubáltuk 10 percig szobahőmérsékleten. Az elhalt sejtek szelektív Evans-kék festése a festéknek az életképes sejtekből az ép plazmamembrán általi kipréselődésétől függ. A festett sejteket világos látóterű mikroszkóppal (BX53, Olympus) figyeltük meg.
A HeLa sejteket 10% FBS-sel kiegészített DMEM táptalajban, párásított inkubátorban, 37°C-on, 5% CO2 atmoszférában tenyésztettük. A sejteket 100 μM KAND 11-gyel, kumamonaminsav 6-tal, kumamonamid 1-gyel, 100 ng/ml kolcemiddel (Gibco) vagy 100 ng/ml Nocodmaze-zal (Sigma) kezeltük 6 órán át 37°C-on. A sejteket 10 percig metanollal, majd 5 percig acetáttal fixáltuk szobahőmérsékleten. A fixált sejteket 0,5% BSA/PBS-ben hígított β-tubulin primer antitesttel (1D4A4, Proteintech: 66240-1) inkubáltuk 2 órán át, majd háromszor mostuk TBST-vel, végül pedig Alexa Fluor kecske antitesttel inkubáltuk. 488 1 óra. – Egér IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) és 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 0,5% BSA/PBS-ben hígítva. Háromszori TBST-s mosás után a festett sejteket Nikon Eclipse Ti-E inverz mikroszkópon figyeltük meg. A képeket hűtött Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerával rögzítettük MetaMorph szoftver (Molecular Devices) segítségével.
Közzététel ideje: 2024. június 17.