Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb eredmény érdekében javasoljuk, hogy használja a böngésző újabb verzióját (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílus vagy JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A természetes termékek felfedezése és jótékony felhasználása javíthatja az emberi életet.A növényi növekedést gátló vegyszereket széles körben alkalmazzák gyomirtó szerként a gyomok irtására.A különböző típusú gyomirtó szerek alkalmazásának szükségessége miatt új hatásmechanizmusú vegyületek azonosítására van szükség.Ebben a tanulmányban felfedeztük a Streptomyces werraensis MK493-CF1-ből származó új N-alkoxi-pirrol vegyületet, a kumamonamidot, és létrehoztuk a teljes szintézis folyamatát.Biológiai aktivitási vizsgálatok során felfedeztük, hogy az urs-monoaminsav az urs-monoamid szintetikus köztiterméke és potenciálisnövényi növekedés gátló.Emellett különféle urbenonsav-származékokat fejlesztettünk ki, köztük az urbeniloxi-származékot (UDA), amely magas gyomirtó hatású anélkül, hogy negatívan befolyásolná a HeLa sejtek növekedését.Azt is megállapítottuk, hogy az urmotonsav-származékok megzavarják a növényi mikrotubulusokat;emellett a KAND hatással van az aktin filamentumokra és sejthalált indukál;Ezek a sokrétű hatások eltérnek az ismert mikrotubulus-inhibitorokétól, és az urzonsav új hatásmechanizmusát sugallják, ami fontos előnyt jelent az új gyomirtó szerek kifejlesztésében.
A jótékony hatású természetes termékek és származékaik felfedezése és gyakorlati alkalmazása az emberi életminőség javításának eszköze.A mikroorganizmusok, növények és rovarok által termelt másodlagos metabolitok jelentős előrelépéshez vezettek az orvostudományban és a mezőgazdaságban.Számos antibiotikumot és leukémia elleni gyógyszert fejlesztettek ki természetes termékekből.Ezen kívül különféle típusúrovarirtók, gombaölő és gyomirtó szereket vonnak ki ezekből a természetes termékekből mezőgazdasági felhasználásra.A modern mezőgazdaságban különösen a gyomirtó herbicidek fontos eszközei a terméshozam növelésének, és különféle típusú vegyületeket már kereskedelmi forgalomban is alkalmaznak.A növényekben számos sejtes folyamat, mint például a fotoszintézis, az aminosav-anyagcsere, a sejtfalszintézis, a mitózis szabályozása, a fitohormon jelátvitel vagy a fehérjeszintézis a herbicidek tipikus célpontjának tekinthető.A mikrotubulusok működését gátló vegyületek a gyomirtó szerek gyakori osztályát képezik, amelyek a mitotikus szabályozás befolyásolásával befolyásolják a növények növekedését2.
A mikrotubulusok a citoszkeleton alkotóelemei, és széles körben konzerváltak az eukarióta sejtekben.A tubulin heterodimer α-tubulinból és β-tubulinból áll, amelyek lineáris mikrotubulus protofilamentumokat alkotnak, és 13 protofilament alkot hengeres szerkezetet.A mikrotubulusok többféle szerepet játszanak a növényi sejtekben, beleértve a sejt alakjának meghatározását, a sejtosztódást és az intracelluláris transzportot3,4.A növényi sejtek mikrotubulusokat tartalmaznak az interfázisú plazmamembrán alatt, és úgy gondolják, hogy ezek az úgynevezett kérgi mikrotubulusok a cellulóz-szintáz komplexek szabályozásán keresztül szabályozzák a cellulóz mikrofibrillumok szerveződését4,5.A gyökéri epidermális sejtek kérgi mikrotubulusai, amelyek a gyökércsúcs gyors megnyúlásának zónájában találhatók, oldalirányban helyezkednek el, és a cellulóz mikroszálak követik ezeket a mikrotubulusokat és korlátozzák a sejttágulás irányát, elősegítve ezzel az anizotrop sejtmegnyúlást.Ezért a mikrotubulusok működése szorosan összefügg a növény morfológiájával.A tubulint kódoló gének aminosav-szubsztitúciói a kérgi mikrotubulusok torzulását és bal vagy jobb oldali növekedést okoznak Arabidopsis 6,7-ben.Hasonlóképpen, a mikrotubulusokhoz kapcsolódó fehérjék mutációi, amelyek szabályozzák a mikrotubulusok dinamikáját, szintén torz gyökérnövekedéshez vezethetnek8,9,10,11,12,13.Ezenkívül a mikrotubulusokat szétroncsoló gyomirtó szerekkel, például dizopiramiddal, más néven pretilaklórral végzett kezelés szintén bal oldali ferde gyökérnövekedést okoz14.Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mikrotubulusok működésének pontos szabályozása kritikus a növény növekedési irányának meghatározásához.
Különféle típusú mikrotubulus-gátlókat fedeztek fel, és ezek a gyógyszerek jelentős mértékben hozzájárultak a citoszkeletális kutatáshoz, valamint a mezőgazdasághoz és az orvostudományhoz2.Különösen az orizalin, a dinitroanilin-vegyületek, a dizopiramid, a benzamiddal rokon vegyületek és analógjaik gátolhatják a mikrotubulusok működését, és ezáltal gátolhatják a növények növekedését.Ezért széles körben használják gyomirtó szerként.Mivel azonban a mikrotubulusok a növényi és állati sejtek fontos alkotóelemei, a legtöbb mikrotubulus inhibitor mindkét sejttípusra citotoxikus.Ezért annak ellenére, hogy gyomirtó szerként ismertek, korlátozott számú mikrotubulus-ellenes szert használnak gyakorlati célokra.
A Streptomyces a Streptomyces családba tartozó nemzetség, amely aerob, gram-pozitív, fonalas baktériumokat foglal magában, és széles körben ismert másodlagos metabolitok széles skáláját előállító képességéről.Ezért az új biológiailag aktív természetes termékek egyik legfontosabb forrásának tartják.A jelenlegi tanulmányban felfedeztünk egy új, koumamonamid nevű vegyületet, amelyet Streptomyces werraensis MK493-CF1 és S. werraensis ISP 5486 törzsekből izoláltunk. Spektrális elemzés és teljes spektrális analízis segítségével jellemeztük a koumamonamid szerkezetét és egyedi N-alkoxipirrol vázát. határozott volt.szintézis.Az ursmonsavról, az ursmonoamid és származékainak szintetikus köztitermékéről azt találták, hogy gátolja a népszerű Arabidopsis thaliana modellnövény növekedését és csírázását.Egy szerkezet-aktivitás kapcsolati vizsgálat során azt találtuk, hogy az ursonsavvá módosított C9-et tartalmazó vegyület, az ursonsav noniloxi-származéka (KAND), jelentősen fokozza a növekedést és csírázást gátló hatást.Figyelemre méltó, hogy az újonnan felfedezett növényi növekedést gátló szer a dohány és a májfű növekedésére is hatással volt, és nem volt citotoxikus a baktériumokra vagy a HeLa-sejtekre.Ezenkívül egyes urmotonsav-származékok torz gyökérfenotípust indukálnak, ami arra utal, hogy ezek a származékok közvetlenül vagy közvetve befolyásolják a mikrotubulusokat.Ezzel az elképzeléssel összhangban az immunhisztokémiailag vagy fluoreszcens fehérjékkel jelölt mikrotubulusokra vonatkozó megfigyeléseink azt mutatják, hogy a KAND kezelés depolimerizálja a mikrotubulusokat.Ezenkívül a kumamotonsav-származékokkal végzett kezelés megbontotta az aktin mikrofilamentumokat.Így felfedeztünk egy új növényi növekedésgátlót, amelynek egyedi hatásmechanizmusa a citoszkeleton elpusztítása.
Az MK493-CF1 törzset Shinagawa-kuban (Tokió) izolálták a talajból.Az MK493-CF1 törzs jól elágazó stromális micéliumot képezett.Meghatároztuk a 16S riboszomális RNS gén részleges szekvenciáját (1422 bp).Ez a törzs nagyon hasonlít a S. werraensis-hez (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipikus törzs, 99,93%).Ezen eredmény alapján megállapítottuk, hogy ez a törzs szoros rokonságban áll a S. werraensis típusú törzsével.Ezért ezt a törzset ideiglenesen S. werraensis MK493-CF1-nek neveztük el.A S. werraensis ISP 5486T szintén ugyanazokat a bioaktív vegyületeket termeli.Mivel korai kutatások kevés volt a természetes termékek ebből a mikroorganizmusból való kinyerésére vonatkozóan, további kémiai kutatásokat végeztek.Miután a S. werraensis MK493-CF1-et árpa táptalajon, szilárd fázisú fermentációval 30 °C-on 14 napig tenyésztettük, a táptalajt 50%-os etanollal extraháltuk.60 ml mintát szárítunk, így 59,5 mg nyers kivonatot kapunk.A nyers extraktumot fordított fázisú HPLC-nek vetjük alá, így 36,0 mg N-metoxi-1 H-pirrol-2-karboxamidot kapunk (1, coumamonamid néven).Az 1 teljes mennyisége a nyers kivonat körülbelül 60%-a.Ezért úgy döntöttünk, hogy részletesen tanulmányozzuk a kumamotoamid 1 tulajdonságait.
A Coumamonamid 1 fehér amorf por, és a nagy felbontású tömegspektrometria (HRESIMS) megerősíti a C6H8N2O2 jelenlétét (1. ábra).Ennek a vegyületnek a C2-szubsztituált pirrol-fragmensét δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, 8H az 1H-NMR-spektrumban: 4,5 Hz) jellemzik. , H-5) és 8H 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), és a13C NMR spektrum négy sp2 szénatom jelenlétét mutatja.Az amidcsoport jelenlétét a C2-helyzetben a C-3 proton és az amid-karbonil-szén közötti HMBC-korreláció alapján határoztuk meg δC 161,1-nél.Ezenkívül az1H- és13C-NMR-csúcsok δH 4,10 (3H, S) és δC 68,3 értékeknél N-metoxicsoportok jelenlétét jelzik a molekulában.Bár a metoxicsoport helyes helyzetét még nem határozták meg spektroszkópiai analízissel, például fokozott differenciálspektroszkópiával és a nukleáris Overhauser-rövidítéssel (NOEDF), az N-metoxi-1H-pirrol-2-karboxamid lett az első jelölt vegyület.
Az 1 helyes szerkezetének meghatározásához teljes szintézist végeztünk (2a. ábra).A kereskedelemben kapható 2-amino-piridin 2 m-CPBA-val történő kezelése a megfelelő N-oxid 3-at eredményezte kvantitatív kitermeléssel.A 2 vegyület 2-amino-azidálása után az Abramovich által leírt ciklokondenzációs reakciót benzolban 90 °C-on hajtottuk végre, így a kívánt 1-hidroxi-1H-pirrol-2-karbonitrilt kaptuk grammokban.Sebesség 60% (két fokozat).15,16.A 4 vegyület metilezése és hidrolízise után jó hozammal (70%, két lépés) 1-metoxi-1H-pirrol-2-karbonsavat kapunk (amit „kumotonsavnak” neveznek, 6).Végül a 6. savklorid intermedieren keresztül vizes ammóniával végzett amidálással az 1. Kumamoto-amidot kaptuk 98%-os kitermeléssel.A szintetizált 1 minden spektrális adata hasonló volt az izolált 1-hez, így meghatároztuk az 1 szerkezetét;
Az urbenamid és az urbensav biológiai aktivitásának általános szintézise és elemzése.a) A Kumamoto amid teljes szintézise.(b) Hét napos vad típusú Arabidopsis Columbia (Col) palántákat neveltünk Murashige és Skoog (MS) lemezeken, amelyek 6-os koumamonamidot vagy kumamonamid 1-et tartalmaztak a jelzett koncentrációkban.Mérlegrúd = 1 cm.
Először is felmértük az urbenamid és intermediereinek biológiai aktivitását a növénynövekedést befolyásoló képességük szempontjából.Különféle koncentrációjú ursmonamid 1-et vagy ursmonsav 6-ot adtunk az MS agar táptalajhoz, és ezen a táptalajon Arabidopsis thaliana palántákat tenyésztettünk.Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a 6 magas koncentrációja (500 μM) gátolja a gyökérnövekedést (2b. ábra).Ezt követően a 6-os N1 pozíció behelyettesítésével különféle származékokat állítottunk elő, és ezeken szerkezet-aktivitás kapcsolati vizsgálatokat végeztünk (az analóg szintézis folyamatát az alátámasztó információ (SI) ismerteti).Az Arabidopsis palántákat 50 μM urzonsav-származékot tartalmazó táptalajon neveltük, és mértük a gyökérhosszt.ahogy a képen is látszik.A 3a., b. és S1. ábrákon látható módon a kumamosavaknak különböző hosszúságú lineáris alkoxiláncai (9, 10, 11, 12 és 13) vagy nagy alkoxiláncai (15, 16 és 17) vannak az N1 pozícióban.A származékok a gyökérnövekedés jelentős gátlását mutatták.Ezenkívül azt találtuk, hogy 200 μM 10, 11 vagy 17 alkalmazása gátolta a csírázást (3c. és S2. ábra).
A Kumamoto amid és rokon vegyületek szerkezet-aktivitás kapcsolatának vizsgálata.(a) Analógok szerkezete és szintézise.(b) MS táptalajon nevelt 7 napos palánták gyökérhosszának számszerűsítése 50 μM kumamonamid származékkal vagy anélkül.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a színlelt kezeléssel szemben (t-teszt, p< 0,05).n>18. Az adatok átlag ± SD.Az nt jelentése „nem tesztelt”, mert a magok több mint 50%-a nem csírázott.(c) A 7 napig MS táptalajban 200 μM kumamonamiddal és rokon vegyületekkel vagy anélkül inkubált kezelt magvak csírázási sebességének számszerűsítése.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a színlelt kezelés (khi-négyzet teszt) között.n=96.
Érdekes módon a C9-nél hosszabb alkil-oldalláncok hozzáadása csökkentette a gátló aktivitást, ami arra utal, hogy a kumamotoinsavval rokon vegyületeknek bizonyos méretű oldalláncokra van szükségük ahhoz, hogy biológiai aktivitásukat kifejtsék.
Mivel a szerkezet-aktivitás összefüggés elemzése kimutatta, hogy a C9 urzonsavvá módosult, és az ursonsav noniloxi-származéka (a továbbiakban: KAND 11) a leghatékonyabb növényi növekedést gátló, ezért részletesebben is leírtuk a KAND 11-et. Arabidopsis kezelése. 50 μM KAND 11-gyel szinte teljesen megakadályozták a csírázást, míg a KAND 11 alacsonyabb koncentrációi (40, 30, 20 vagy 10 μM) dózisfüggő módon gátolta a gyökérnövekedést (4a, b ábra).Annak tesztelésére, hogy a KAND 11 befolyásolja-e a gyökér merisztéma életképességét, megvizsgáltuk a propidium-jodiddal (PI) festett gyökérmerisztémákat és megmértük a merisztéma terület méretét.A 25 μM KAND-11-et tartalmazó táptalajon nevelt palánták merisztéma mérete 151,1 ± 32,5 μm, míg a DMSO tartalmú kontroll táptalajon nevelt palánták merisztémája 264,7 ± 30,8 μm volt, (4c. ábra) , ami azt jelzi, hogy a KAND-11 helyreállítja a sejtaktivitást.terjed.Gyökér merisztéma.Ezzel összhangban a KAND 11 kezelés csökkentette a sejtosztódási marker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS jelét a gyökérmerisztémában (4e. ábra) 17 .Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a KAND 11 gátolja a gyökérnövekedést a sejtproliferációs aktivitás csökkentésével.
Az urbenonsav-származékok (urbeniloxi-származékok) növekedést gátló hatásának elemzése.(a) 7 napos vad típusú Col palánták, amelyeket MS lemezeken neveltek a KAND 11 jelzett koncentrációival. Skálaoszlop = 1 cm.(b) A gyökérhossz számszerűsítése.A betűk szignifikáns különbségeket jeleznek (Tukey HSD-teszt, p< 0,05).n>16. Az adatok átlag ± SD.(c) Propidium-jodiddal festett vad típusú Col gyökerek konfokális mikroszkópos vizsgálata MS lemezeken 25 μM KAND 11-gyel vagy anélkül. A fehér zárójelek a gyökérmerisztémát jelzik.Skálasáv = 100 µm.d) A gyökérmerisztéma méretének meghatározása (n = 10–11).A statisztikai különbségeket t-próbával határoztuk meg (p< 0,05).A sávok az átlagos merisztémaméretet mutatják.(e) a CDKB2 konstrukciót tartalmazó gyökérmerisztéma differenciális interferencia-kontraszt (DIC) mikroszkópja;1pro: CDKB2;1-GUS festett és festett 5 napos palántákon MS lemezeken 25 µM KAND vizsgálattal vagy anélkül.
A KAND 11 fitotoxicitását egy másik kétszikű növény, a dohány (Nicotiana tabacum) és egy jelentős szárazföldi növényi modellszervezet, a májfű (Marchantia polymorpha) felhasználásával vizsgáltuk tovább.Akárcsak az Arabidopsis esetében, a 25 μM KAND 11-et tartalmazó táptalajon nevelt dohány SR-1 palánták rövidebb gyökereket hoztak létre (5a. ábra).Ezenkívül 48 magból 40 csírázott 200 μM KAND 11-et tartalmazó lemezeken, míg mind a 48 mag ál-kezelt táptalajon csírázott, ami azt jelzi, hogy a KAND magasabb koncentrációja szignifikáns volt (p< 0,05;chi teszt -négyzet) gátolta a dohány csírázását.(5b. ábra).Ezenkívül a KAND 11 koncentrációja, amely gátolta a baktériumok szaporodását májfűben, hasonló volt az Arabidopsisban mért hatékony koncentrációhoz (5c. ábra).Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a KAND 11 képes gátolni számos növény növekedését.Ezután megvizsgáltuk a medve monoamiddal rokon vegyületek lehetséges citotoxicitását más szervezetekben, nevezetesen a humán HeLa sejtekben és az Escherichia coli DH5α törzsben, mint a magasabbrendű állati, illetve bakteriális sejtek képviselőiben.Egy sor sejtproliferációs vizsgálat során megfigyeltük, hogy a kumamonamid 1, a kumamonamidsav 6 és a KAND 11 nem befolyásolta a HeLa vagy E. coli sejtek növekedését 100 μM koncentrációban (5d, e ábra).
A KAND 11 növekedésének gátlása nem Arabidopsis szervezetekben.(a) Kéthetes vad típusú SR-1 dohánypalántákat neveltünk függőlegesen elhelyezett MS lemezeken, amelyek 25 μM KAND 11-et tartalmaztak. (b) Kéthetes, vad típusú SR-1 dohánypalántákat neveltünk vízszintesen elhelyezett helyen. 200 μM KAND 11-et tartalmazó MS lemezek. (c) Kéthetes vad típusú Tak-1 májfű rügyek Gamborg B5 lemezeken a feltüntetett KAND 11 koncentrációkkal. Piros nyilak jelzik azokat a spórákat, amelyek növekedése leállt a kéthetes inkubáció alatt időszak.(d) HeLa sejtek sejtproliferációs vizsgálata.Az életképes sejtek számát 8-as sejtszámláló kittel (Dojindo) rögzített időközönként mértük.Kontrollként a HeLa sejteket 5 μg/ml aktinomicin D-vel (Act D) kezeltük, amely gátolja az RNS polimeráz transzkripciót és sejthalált okoz.Az elemzéseket három párhuzamosban végeztük.(e) E. coli sejtproliferációs vizsgálat.Az E. coli növekedését OD600 mérésével elemeztük.Kontrollként a sejteket 50 μg/ml ampicillinnel (Amp) kezeltük, amely gátolja a bakteriális sejtfal szintézisét.Az elemzéseket három párhuzamosban végeztük.
Az uramid-rokon vegyületek által okozott citotoxicitás hatásmechanizmusának megfejtésére a mérsékelt gátló hatású urbénsav-származékokat újra elemeztük.ahogy a képen is látszik.A 2b. és 6a. ábrákon látható, hogy a magas koncentrációban (200 μM) urmotonsav 6-ot tartalmazó agarlemezeken termesztett palánták rövidebb és balra ívelt gyökereket hoztak létre (θ = – 23,7 ± 6,1), míg a kontroll táptalajon nevelt palánták a palánták közel egyenes gyökeret hoztak (θ = – 3,8 ± 7,1).Ez a jellegzetes ferde növekedés köztudottan a kortikális mikrotubulusok diszfunkciójának eredménye14,18.Ezzel a megállapítással összhangban a mikrotubulus-destabilizáló gyógyszerek, a dizopiramid és az orizalin hasonló gyökérbillentést indukáltak növekedési körülményeink között (2b., 6a. ábra).Ezzel egyidejűleg urmotonsav származékokat is teszteltünk, és közülük néhányat kiválasztottunk, amelyek bizonyos koncentrációkban ferde gyökérnövekedést váltottak ki.A 8., 9. és 15. vegyület megváltoztatta a gyökérnövekedés irányát 75 µM, 50 µM és 40 µM mellett, jelezve, hogy ezek a vegyületek hatékonyan destabilizálhatják a mikrotubulusokat (2b., 6a. ábra).Teszteltük a legerősebb urzolsav-származékot, a KAND 11-et is alacsonyabb koncentrációban (15 µM), és azt találtuk, hogy a KAND 11 alkalmazása gátolja a gyökérnövekedést, és a gyökérnövekedés iránya egyenetlen, bár hajlamos volt balra dőlni ( C3. ábra)..Mivel a mikrotubulusokat destabilizáló gyógyszerek magasabb koncentrációi néha inkább gátolják a növények növekedését, mintsem a gyökér megdöntését okozzák, ezt követően megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy a KAND 11 befolyásolja a mikrotubulusokat a gyökér epidermális sejtjeiben lévő kérgi mikrotubulusok megfigyelésével.A 25 μM KAND 11-gyel kezelt palántagyökerek epidermális sejtjeiben anti-β-tubulin antitestek felhasználásával végzett immunhisztokémia azt mutatta, hogy szinte az összes kérgi mikrotubulus eltűnt az epidermális sejtekben az elongációs zónában (6b. ábra).Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kumamotonsav és származékai közvetlenül vagy közvetve hatnak a mikrotubulusokra, és megzavarják azokat, és ezek a vegyületek új mikrotubulus-gátlók.
Az ursonsav és származékai megváltoztatják az Arabidopsis thaliana kérgi mikrotubulusait.(a) A gyökér hajlásszöge különböző urmotonsav-származékok jelenlétében a jelzett koncentrációkban mérve.A mikrotubulusokat gátló két vegyület, a dizopiramid és az orizalin hatását is elemeztük.A betét mutatja a gyökérnövekedési szög mérésére használt szabványt.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a színlelt kezeléssel szemben (t-teszt, p< 0,05).n>19. Mérlegrúd = 1 cm.(b) Kortikális mikrotubulusok az epidermális sejtekben az elongációs zónában.A vad típusú Arabidopsis Col gyökerekben MS lemezeken tenyésztett mikrotubulusokat 25 μM KAND 11-gyel vagy anélkül immunhisztokémiai festéssel tettük láthatóvá β-tubulin primer antitestek és Alexa Fluor-konjugált másodlagos antitestek felhasználásával.Skálasáv = 10 µm.(c) A mikrotubulusok mitotikus szerkezete a gyökérmerisztémában.A mikrotubulusokat immunhisztokémiai festéssel tettük láthatóvá.A mitotikus struktúrákat, beleértve a profázis zónákat, orsókat és phragmoplasztokat, konfokális képekből számolták meg.A nyilak a mitotikus mikrotubulus-struktúrákat jelzik.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a színlelt kezeléssel szemben (t-teszt, p< 0,05).n>9. Skálasáv = 50 µm.
Bár az Ursa képes megzavarni a mikrotubulusok működését, hatásmechanizmusa várhatóan eltér a tipikus mikrotubulus-depolimerizáló szerekétől.Például a mikrotubulus-depolimerizáló szerek, például a dizopiramid és az orizalin magasabb koncentrációi az epidermális sejtek anizotrop expanzióját váltják ki, míg a KAND 11 nem.Ezenkívül a KAND 11 és a dizopiramid együttes alkalmazása kombinált, dizopiramid által kiváltott gyökérnövekedési választ és a KAND 11 által kiváltott növekedésgátlást eredményezett (S4. ábra).Elemeztük a túlérzékeny disopiramid 1-1 (phs1-1) mutáns KAND 11-re adott válaszát is. A phs1-1 nem kanonikus tubulin kináz pontmutációval rendelkezik, és rövidebb gyökereket hoz létre, ha dizopiramiddal kezelik9,20.A KAND 11-et tartalmazó agar táptalajon nevelt phs1-1 mutáns palántáknak rövidebb gyökerei voltak, hasonlóan a dizopiramison termesztettekhez (S5. ábra).
Ezenkívül mitotikus mikrotubulus-struktúrákat, például profáz zónákat, orsókat és phragmoplasztokat figyeltünk meg a KAND 11-gyel kezelt palánták gyökérmerisztémájában. A CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS megfigyeléseivel összhangban a a mitotikus mikrotubulusok számát figyelték meg (.6c. ábra).
A KAND 11 citotoxicitásának jellemzésére szubcelluláris felbontásban a dohány BY-2 szuszpenziós sejteket KAND 11-gyel kezeltük, és megfigyeltük válaszukat.Először hozzáadtuk a KAND 11-et a TagRFP-TUA6-ot expresszáló BY-2 sejtekhez, amely fluoreszcensen jelöli a mikrotubulusokat, hogy felmérjük a KAND 11 hatását a kortikális mikrotubulusokra.A kortikális mikrotubulusok sűrűségét képanalízissel határozták meg, amely számszerűsítette a citoszkeletális pixelek százalékos arányát a citoplazmatikus pixelek között.A vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy 1 órás 50 μM vagy 100 μM KAND 11 kezelés után a denzitás szignifikánsan csökkent, 0,94 ± 0,74%-ra, illetve 0,23 ± 0,28%-ra, míg a DMSO-val kezelt sejtek sűrűsége 1,61 ± 0,61 % (7a. ábra).Ezek az eredmények összhangban vannak az Arabidopsis-ban megfigyelt megfigyeléssel, miszerint a KAND 11 kezelés a kérgi mikrotubulusok depolimerizációját váltja ki (6b. ábra).Megvizsgáltuk a BY-2 vonalat is GFP-ABD-vel jelölt aktin filamentumokkal azonos koncentrációjú KAND 11 kezelés után, és megfigyeltük, hogy a KAND 11 kezelés megszakította az aktin filamentumokat.Az 50 μM vagy 100 μM KAND 11-gyel végzett kezelés 1 órán keresztül szignifikánsan csökkentette az aktin filamentum sűrűségét 1,20 ± 0,62%-ra, illetve 0,61 ± 0,26%-ra, míg a DMSO-val kezelt sejtekben a sűrűség 1,69 ± 0,51% volt.7b).Ezek az eredmények ellentétben állnak a propizamid hatásával, amely nem befolyásolja az aktin filamentumokat, és a latrunculin B, egy aktin depolimerizáló hatásával, amely nem befolyásolja a mikrotubulusokat (SI S6 ábra).Ezenkívül a koumamonamid 1, komamonamid sav 6 vagy KAND 11 kezelés nem befolyásolta a mikrotubulusokat a HeLa sejtekben (SI S7 ábra).Így a KAND 11 hatásmechanizmusa eltér az ismert citoszkeleton-bontókétól.Ezenkívül a KAND 11-gyel kezelt BY-2 sejtek mikroszkópos megfigyelése feltárta a sejthalál kezdetét a KAND 11 kezelés során, és azt mutatta, hogy az Evans kékkel festett elhalt sejtek aránya nem nőtt jelentősen 30 perces KAND 11 kezelés után, míg 90 perces 50 μM vagy 100 μM KAND kezelés után az elhalt sejtek száma 43,7%-ra, illetve 80,1%-ra nőtt (7c. ábra).Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy az új urzolsav-származék, a KAND 11, egy növényspecifikus citoszkeletális inhibitor, korábban ismeretlen hatásmechanizmussal.
A KAND hatással van a kortikális mikrotubulusokra, az aktin filamentumokra és a dohány BY-2 sejtek életképességére.(a) Kortikális mikrotubulusok megjelenítése BY-2 sejtekben TagRFP-TUA6 jelenlétében.A KAND 11-gyel (50 μM vagy 100 μM) vagy DMSO-val kezelt BY-2 sejteket konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk.A kortikális mikrotubulussűrűséget 25 független sejt mikroképeiből számítottuk ki.A betűk szignifikáns különbségeket jeleznek (Tukey HSD-teszt, p< 0,05).Skálasáv = 10 µm.(b) Kortikális aktin filamentumok BY-2 sejtekben GFP-ABD2 jelenlétében láthatóvá.A KAND 11-gyel (50 μM vagy 100 μM) vagy DMSO-val kezelt BY-2 sejteket konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk.A kortikális aktin filamentumok sűrűségét 25 független sejt mikrofelvételeiből számítottuk ki.A betűk szignifikáns különbségeket jeleznek (Tukey HSD-teszt, p< 0,05).Skálasáv = 10 µm.(c) Az elhalt BY-2 sejtek megfigyelése Evans-kék festéssel.A KAND 11-gyel (50 μM vagy 100 μM) vagy DMSO-val kezelt BY-2 sejteket fényes terű mikroszkóppal vizsgáltuk.n=3.Skálasáv = 100 µm.
Az új természetes termékek felfedezése és alkalmazása jelentős előrelépésekhez vezetett az emberi élet különböző területein, beleértve az orvostudományt és a mezőgazdaságot.Történelmi kutatásokat végeztek a természeti erőforrásokból hasznos vegyületek kinyerésére.Közelebbről ismert, hogy az aktinomyceták parazitaellenes antibiotikumként hasznosak fonálférgeknél, mivel képesek különféle másodlagos metabolitokat, például avermektint, az ivermektin és bleomicin vezető vegyületét és származékait termelni, amelyeket gyógyászatilag rákellenes szerként használnak21,22.Hasonlóképpen számos gyomirtó vegyületet fedeztek fel aktinomycetákból, amelyek közül néhányat már kereskedelmi forgalomban is alkalmaznak1,23.Ezért az aktinomyceta metabolitok elemzése a kívánt biológiai aktivitású természetes termékek izolálására hatékony stratégiának tekinthető.Ebben a tanulmányban felfedeztünk egy új vegyületet, a kumamonamidot a S. werraensisből, és sikeresen szintetizáltuk azt.Az urzonsav az urbenamid és származékai szintetikus köztiterméke.Jellegzetes gyökérgöndörödést okozhat, mérsékelt vagy erős gyomirtó hatást fejthet ki, és közvetlenül vagy közvetve károsíthatja a növényi mikrotubulusokat.Az urmotonsav hatásmechanizmusa azonban eltérhet a meglévő mikrotubulus-inhibitorokétól, mivel a KAND 11 az aktin filamentumokat is megbontja és sejthalált okoz, ami arra utal, hogy az urmotonsav és származékai a citoszkeletális struktúrák széles skáláját befolyásolják..
Az urbenonsav további részletes jellemzése segít az urbenonsav hatásmechanizmusának jobb megértésében.A következő cél különösen az ursonsav redukált mikrotubulusokhoz való kötődési képességének értékelése annak megállapítása érdekében, hogy az urzonsav és származékai közvetlenül hatnak-e a mikrotubulusokra és depolimerizálják-e azokat, vagy hatásuk a mikrotubulusok destabilizációjához vezet.Ezenkívül abban az esetben, ha a mikrotubulusok nem közvetlen célpontok, az urzonsav hatásának és molekuláris célpontjainak azonosítása a növényi sejteken segít jobban megérteni a rokon vegyületek tulajdonságait és a gyomirtó hatás javításának lehetséges módjait.Bioaktivitási vizsgálatunk kimutatta az ursonsav egyedülálló citotoxikus képességét olyan növények növekedésére, mint az Arabidopsis thaliana, a dohány és a májfű, miközben sem az E. coli, sem a HeLa sejtek nem voltak érintettek.Az urzonsav-származékok előnye, hogy csekély vagy egyáltalán nem toxikusak az állati sejtekre, ha nyílt mezőgazdasági területeken történő gyomirtó szerként fejlesztették ki őket.Valójában, mivel a mikrotubulusok gyakori struktúrák az eukariótákban, szelektív gátlásuk növényekben kulcsfontosságú követelmény a herbicideknél.Például a propizamidot, egy mikrotubulus-depolimerizáló szert, amely közvetlenül kötődik a tubulinhoz és gátolja a polimerizációt, gyomirtó szerként használják, mivel alacsony toxicitása az állati sejtekre nézve24.A dizopiramiddal ellentétben a rokon benzamidok eltérő célspecifitással rendelkeznek.A növényi mikrotubulusok mellett az RH-4032 vagy a benzoxamid gátolja az állati sejtek, illetve a petesejtek mikrotubulusait is, a zalilamidet pedig alacsony fitotoxicitása miatt fungicidként használják25,26,27.Az újonnan felfedezett medve és származékai szelektív citotoxicitást mutatnak a növényekkel szemben, de érdemes megjegyezni, hogy a további módosítások megváltoztathatják a célspecifitását, potenciálisan további származékokat biztosítva a patogén gombák vagy oomyceták elleni védekezéshez.
Az urbenonsav és származékai egyedülálló tulajdonságai hasznosak gyomirtóként történő fejlesztésükben és kutatási eszközként történő felhasználásukban.A citoszkeleton jelentősége a növényi sejtek alakjának szabályozásában széles körben elismert.Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a növények a kortikális mikrotubulusok szerveződésének összetett mechanizmusait fejlesztették ki a mikrotubulusok dinamikájának szabályozásával a morfogenezis megfelelő szabályozása érdekében.A mikrotubulusok aktivitásának szabályozásáért felelős nagyszámú molekulát azonosítottak, és a kapcsolódó kutatások még mindig folynak3,4,28.A növényi sejtekben a mikrotubulusok dinamikájának jelenlegi ismereteink nem magyarázzák meg teljes mértékben a kortikális mikrotubulusok szerveződésének mechanizmusait.Például, bár a dizopiramid és az orizalin is képes depolimerizálni a mikrotubulusokat, a dizopiramid súlyos gyökértorzulást okoz, míg az orizalin viszonylag enyhe hatású.Ezenkívül a mikrotubulusokat stabilizáló tubulin mutációi szintén jobbra forgatást okoznak a gyökerekben, míg a paclitaxel, amely szintén stabilizálja a mikrotubulusok dinamikáját, nem.Ezért az urzolsav molekuláris célpontjainak tanulmányozása és azonosítása új betekintést nyújt a növényi kérgi mikrotubulusok szabályozásába.Hasonlóképpen, a torz növekedést elősegítő vegyszerek, például a dizopiramid, és a kevésbé hatékony vegyszerek, például az orizalin vagy a kumamotorsav jövőbeni összehasonlítása támpontokat ad a torz növekedés kialakulásához.
Másrészt a védekezéssel összefüggő citoszkeletális átrendeződések egy másik lehetőség az ursonsav citotoxicitásának magyarázatára.Egy kórokozó fertőzése vagy egy elicitor bejutása a növényi sejtekbe néha a citoszkeleton pusztulását és ezt követő sejthalált okozza29.Például arról számoltak be, hogy az oomycete-eredetű kriptoxantin a dohánysejtek halála előtt megbontja a mikrotubulusokat és az aktinszálakat, hasonlóan ahhoz, ami a KAND-kezelésnél történik30,31.A védekezési válaszok és az ursonsav által kiváltott sejtes válaszok közötti hasonlóságok arra a hipotézisre vezettek, hogy ezek közös sejtfolyamatokat indítanak el, bár nyilvánvaló, hogy az ursonsav gyorsabb és erősebb, mint a kriptoxantin hatása.A vizsgálatok azonban kimutatták, hogy az aktin filamentumok megszakadása elősegíti a spontán sejthalált, ami nem mindig jár együtt a mikrotubulusok szétesésével29.Ezen túlmenően még látni kell, hogy akár a kórokozó, akár az elicitor okoz-e torz gyökérnövekedést, ahogyan azt az urzonsavszármazékok teszik.Így a védekezési válaszokat és a citoszkeletont összekapcsoló molekuláris tudás vonzó probléma, amelyet meg kell oldani.Az ursonsavhoz kapcsolódó kis molekulatömegű vegyületek, valamint a különböző hatású származékok jelenlétének kihasználásával lehetőséget kínálhatnak ismeretlen sejtmechanizmusok megcélzására.
Összességében a mikrotubulusok dinamikáját módosító új vegyületek felfedezése és alkalmazása hatékony módszereket kínál a növényi sejtalak meghatározásának hátterében álló összetett molekuláris mechanizmusok kezelésére.Ebben az összefüggésben a nemrég kifejlesztett urmotonsav vegyület, amely a mikrotubulusokra és az aktin filamentumokra hat, és sejthalált indukál, lehetőséget nyújthat a mikrotubulusok szabályozása és ezen egyéb mechanizmusok közötti kapcsolat megfejtésére.Így az urbenonsavat használó kémiai és biológiai elemzés segít megérteni a növényi citoszkeletont szabályozó molekuláris szabályozó mechanizmusokat.
Oltsd be a S. werraensis MK493-CF1-et egy 500 ml-es, 110 ml oltóközeget tartalmazó, 2% (w/v) galaktózt, 2% (w/v) esszencia pasztát, 1% (w/v) Bacto összetételt tartalmazó Erlenmeyer-lombikba .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) kukoricakivonat (KOGOSTCH Co., Ltd., Japán), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 és 0,2% CaCO3 ionmentesített vízben.(pH 7,4 sterilizálás előtt).A magtenyészeteket rotációs rázógépen (180 fordulat/perc) 27 °C-on 2 napig inkubáltuk.Termesztés szilárd fázisú fermentációval.A magtenyészetet (7 ml) egy 500 ml-es K-1 lombikba töltöttük, amely 40 g táptalajt tartalmazott, amely 15 g préselt árpából (MUSO Co., Ltd., Japán) és 25 g ionmentesített vízből (pH nincs beállítva) állt. sterilizálás előtt).).A fermentációt 30 °C-on, sötétben 14 napig végeztük.A fermentációs anyagot 40 ml/palack EtOH-val extraháltuk és centrifugáltuk (1500 g, 4 °C, 10 perc).A tenyészet felülúszóját (60 ml) 10%-os MeOH/EtOAc eleggyel extraháljuk.A szerves réteget csökkentett nyomáson bepárolva 59,5 mg maradékot kapunk, amelyet HPLC-nek vetettünk alá gradiens eluálással (0-10 perc: 90%) fordított fázisú oszlopon (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × hossza 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 perc: 90% H2O/CH3CN - 70% H2O/CH3CN (gradiens), 35-45 perc: 90% H2O/EtOH, 45-155 perc: 90% H2O /EtOH-tól 100% EtOH-ig (gradiens (gradiens), 155-200 perc: 100% EtOH) 1,5 ml/perc áramlási sebesség mellett, fehér amorf por formájában koumamonamidot (1, 36,0 mg) izoláltunk.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDC13) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ számított érték: 141,0659, mért érték: 141,0663, IR νmax: 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 157-157 cm.
A Columbia magvakat (Col-0) az Arabidopsis Biológiai Erőforrás Központtól (ABRC) szereztük be kutatási engedéllyel.A Col-0 magvakat laboratóriumi körülményeink között szaporítottuk és tartottuk fenn, és vad típusú Arabidopsis növényként használtuk.Az Arabidopsis magvakat felületi sterilizáltuk és félerős Murashige és Skoog táptalajban tenyésztettük, amely 2% szacharózt (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etánszulfonsavat (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) tartalmazott. ).) és 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C-on és állandó fényben.A phs1-1 mutáns magjait T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) biztosította.
Az SR-1 törzs magjait T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) biztosította, és vad típusú dohánynövényként használták.A dohánymagvakat felületén sterilizáltuk, és steril vízben áztattuk három éjszakán át a csírázás elősegítése érdekében, majd félerősségű oldatba helyeztük, amely 2% szacharózt, 0,05% (w/v) MES-t és 0,8% gellángumit (Fujifilm Wako Pure Chemical) tartalmazott. Murashige.és Skoog táptalaj) 5,7-es pH-val, és 23 °C-on, állandó megvilágítás mellett inkubáltuk.
A Tak-1 törzset T. Kohchi (Kiotói Egyetem) biztosította, és standard kísérleti egységként használták a májfű vizsgálatához.A Gemmát sterilizált tenyésztett növényekből nyertük, majd 1% szacharózt és 0,3% gellángumit tartalmazó Gamborg B5 táptalajra (Fujifilm Wako Pure Chemical) szélesztettük, és 23 °C-on, folyamatos fény mellett inkubáltuk.
A dohány BY-2 sejteket (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokiói Egyetem) biztosította.A BY-2 sejteket 95-szörösére hígítottuk módosított Linsmeier és Skoog táptalajban, és hetente kiegészítettük 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavval32.A sejtszuszpenziót forgó rázógépen 130 fordulat/perc sebességgel, 27 °C-on, sötétben kevertük.A sejteket 10-szeres térfogatú friss tápközeggel mossuk, és ugyanabban a tápközegben szuszpendáljuk újra.A TagRFP-TUA6 mikrotubulus markert vagy a GFP-ABD2 aktin filamentum markert a karfiol mozaikvírus 35S promotere alatt stabilan expresszáló BY-2 transzgenikus sejtvonalakat a leírtak szerint hoztuk létre33, 34, 35.Ezek a sejtvonalak az eredeti BY-2 sejtvonalhoz hasonló eljárásokkal karbantarthatók és szinkronizálhatók.
A HeLa sejteket Dulbecco módosított Eagle tápközegében (DMEM) (Life Technologies) tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal, 1,2 U/ml penicillinnel és 1,2 μg/ml sztreptomicinnel, 37°C-os inkubátorban 5% CO2-val.
Az ebben a kéziratban leírt kísérleteket a japán biológiai biztonsági előírásoknak és irányelveknek megfelelően végeztük.
A vegyületeket dimetil-szulfoxidban (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) oldottuk fel törzsoldatként, és MS táptalajban hígítottuk Arabidopsis és dohány vagy Gamborg B5 táptalajban májfű esetében.A gyökérnövekedés-gátlási vizsgálathoz lemezenként több mint 10 magot vetettünk a jelzett vegyületeket vagy DMSO-t tartalmazó agar táptalajra.A magokat növekedési kamrában 7 napig inkubáltuk.A palántákat lefényképeztük, és megmértük a gyökerek hosszát.Az Arabidopsis csírázási vizsgálatához lemezenként 48 magot vetettünk 200 μM vegyületet vagy DMSO-t tartalmazó agar táptalajra.Az Arabidopsis magvakat növesztőkamrában neveltük, és a csíráztatás után 7 nappal (dag) megszámoltuk a kicsírázott palánták számát.A dohánycsírázási vizsgálathoz lemezenként 24 magot vetettünk 200 μM KAND-ot vagy DMSO-t tartalmazó agar táptalajra.A dohány magvakat növesztőkamrában neveltük, és 14 nap múlva megszámoltuk a kicsírázott palánták számát.A májfű növekedésének gátlási vizsgálatához minden lemezről 9 embriót szélesztettünk a megadott koncentrációjú KAND vagy DMSO-t tartalmazó agar táptalajra, és 14 napig inkubáltuk egy növekedési kamrában.
Használjon 5 mg/ml propidium-jodiddal (PI) festett palántákat a gyökér merisztéma szerveződésének megjelenítéséhez.A PI jeleket fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg TCS SPE konfokális lézer pásztázó mikroszkóppal (Leica Microsystems).
A gyökerek hisztokémiai festését β-glükuronidázzal (GUS) a Malami és Benfey által leírt protokoll szerint végeztük36.A palántákat 90%-os acetonban egy éjszakán át fixáltuk, 0,5 mg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-β-d-glükuronsavval festettük GUS pufferben 1 órán át, majd hidratált klóraldehid oldatba helyeztük.(8 g klorál-hidrát, 2 ml víz és 1 ml glicerin), és differenciális interferencia-kontrasztmikroszkóppal figyeltük meg, Axio Imager M1 mikroszkóppal (Carl Zeiss).
A gyökérszögeket függőlegesen elhelyezett tányérokon nevelt 7 napos palántákon mértük.Mérje meg a gyökér szögét a gravitációs vektor irányától a 6. lépésben leírtak szerint.
A kortikális mikrotubulusok elrendeződését a leírtak szerint figyelték meg, a protokoll kisebb módosításaival 37 .Az anti-β-tubulin antitestet (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) és az Alexa Fluor 488-hoz konjugált anti-egér IgG-t (Thermo Fisher Scientific: A32723) használtak primer és másodlagos antitestként 1:1000 és 1:100 hígításban, illetőleg.A fluoreszcens képeket TCS SPE konfokális lézeres pásztázó mikroszkóppal (Leica Microsystems) készítettük.Készítsen Z-stack képeket és készítsen maximális intenzitású vetítéseket a gyártó utasításai szerint.
A HeLa sejtproliferációs vizsgálatot a Cell Counting Kit 8 (Dojindo) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint.
Az E. coli DH5a növekedését a sejtsűrűség mérésével elemeztük tenyészetben spektrofotométerrel 600 nm-en (OD600).
A transzgenikus BY-2 sejtekben a citoszkeletális szerveződést CSU-X1 konfokális letapogató eszközzel (Yokogawa) és sCMOS kamerával (Zyla, Andor Technology) felszerelt fluoreszcens mikroszkóp segítségével figyelték meg.A citoszkeletális sűrűséget képanalízissel határozták meg, amely számszerűsítette a citoszkeletális pixelek százalékos arányát a citoplazmatikus pixelek között a konfokális képeken az ImageJ szoftverrel, a leírtak szerint38, 39.
A BY-2 sejtekben a sejthalál kimutatására a sejtszuszpenzió egy alikvot részét 0,05%-os Evans blue-dal inkubáltuk 10 percig szobahőmérsékleten.Az elhalt sejtek szelektív Evans-kék festése attól függ, hogy a festéket az életképes sejtekből az érintetlen plazmamembrán extrudálja40.A megfestett sejteket fényerejű mikroszkóppal (BX53, Olympus) figyeltük meg.
A HeLa sejteket 10% FBS-sel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük párásított inkubátorban 37 °C-on és 5% CO2 mellett.A sejteket 100 μM KAND 11-gyel, kumamonámsavval 6, kumamonamid 1-gyel, 100 ng/ml colcemiddel (Gibco) vagy 100 ng/ml Nocodmaze-zel (Sigma) kezeltük 6 órán át 37 °C-on.A sejteket MetOH-val fixáltuk 10 percig, majd acetáttal 5 percig szobahőmérsékleten.A rögzített sejteket 0,5%-os BSA/PBS-ben hígított β-tubulin primer antitesttel (1D4A4, Proteintech: 66240-1) inkubáltuk 2 órán át, 3-szor mostuk TBST-vel, majd Alexa Fluor kecskeantitesttel inkubáltuk.488 1 óra.– Egér IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) és 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI) 0,5% BSA/PBS-ben hígítva.Háromszori TBST-vel végzett mosás után a megfestett sejteket Nikon Eclipse Ti-E fordított mikroszkóppal figyeltük meg.A képeket egy hűtött Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerával rögzítettük a MetaMorph szoftverrel (Molecular Devices).
Feladás időpontja: 2024. június 17