A fenyőfonálféreg egy karanténban lévő vándorló endoparazita, amelyről ismert, hogy súlyos gazdasági veszteségeket okoz a fenyőerdők ökoszisztémáiban. Jelen tanulmány áttekinti a halogénezett indolok fenyőfonálférgek elleni nematicid hatását és hatásmechanizmusát. Az 5-jód-indol és az avermektin (pozitív kontroll) nematicid aktivitása fenyőfonálférgekkel szemben hasonló volt és alacsony koncentrációban (10 μg/ml) magas volt. Az 5-jód-indol csökkentette a termékenységet, a szaporodási aktivitást, az embrionális és lárvapusztulást, valamint a mozgásszervi viselkedést. A ligandumok molekuláris kölcsönhatásai gerinctelen specifikus glutamát-kapuzott kloridcsatorna receptorokkal alátámasztják azt az elképzelést, hogy az 5-jód-indol az avermektinhez hasonlóan szorosan kötődik a receptor aktív helyéhez. Az 5-jódoindol különféle fenotípusos deformációkat is indukált a fonálférgekben, beleértve a kóros szervösszeomlást/zsugorodást és a fokozott vakuolizációt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a vakuolák szerepet játszhatnak a fonálféreg metiláció által közvetített halálában. Fontos, hogy az 5-jód-indol nem volt mérgező mindkét növényfajra (káposzta és retek). Így ez a tanulmány azt bizonyítja, hogy a jód-indol környezeti körülmények között történő alkalmazása képes megfékezni a fenyő hervadási sérülését.
A fenyőfa fonalféreg (Bursaphelenchus xylophilus) a fenyőfa fonálférgekhez (PWN), a vándorló endoparazita fonálférgekhez tartozik, amelyekről ismert, hogy súlyos ökológiai károkat okoznak a fenyőerdők ökoszisztémáiban1. A fenyőfonálféreg által okozott fenyőfonálkór (PWD) komoly problémát jelent több kontinensen, köztük Ázsiában és Európában, Észak-Amerikában pedig a fonálféreg elpusztítja a behurcolt fenyőfajokat1,2. A fenyőfa pusztulása komoly gazdasági probléma, és globális elterjedésének kilátása aggasztó3. Leggyakrabban a következő fenyőfajokat támadja meg a fonálféreg: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii és Pinus radiata4. A fenyőfonálféreg súlyos betegség, amely a fertőzést követő heteken vagy hónapokon belül elpusztíthatja a fenyőfákat. Ezenkívül a fenyőfonálféreg-kitörések gyakoriak számos ökoszisztémában, így tartós fertőzési láncok jöttek létre1.
A Bursaphelenchus xylophilus egy karantén növény-parazita fonálféreg, amely az Aphelenchoidea szupercsaládba és a 102.5 kládba tartozik. A fonálféreg gombákkal táplálkozik, és a fenyőfák faszöveteiben szaporodik, négy különböző lárvaállapotba fejlődve: L1, L2, L3, L4 és egy kifejlett egyed1,6. Táplálékhiány esetén a fenyőfonálféreg egy speciális lárvaállapotba – a dauerbe – kerül át, amely vektorában – a fenyőkéregbogárban (Monochamus alternatus) – parazitál, és átkerül az egészséges fenyőfákba. Egészséges gazdaszervezetben a fonálférgek gyorsan átvándorolnak a növényi szöveteken és parenchimás sejtekkel táplálkoznak, ami számos túlérzékenységi reakcióhoz, fenyő hervadásához és a fertőzést követő egy éven belüli elhaláshoz vezet1,7,8.
A fenyőfonálférgek elleni biológiai védekezés régóta kihívást jelent, a karantén intézkedések már a 20. századra nyúlnak vissza. A fenyőfonálférgek elleni védekezés jelenlegi stratégiái elsősorban vegyi kezeléseket foglalnak magukban, beleértve a fa fertőtlenítését és a nematicidek beültetését a fatörzsekbe. A leggyakrabban használt nematicidek az avermektin és az avermektin-benzoát, amelyek az avermektin családba tartoznak. Ezek a drága vegyszerek nagyon hatékonyak számos fonálféregfaj ellen, és környezetbarátnak tekinthetők9. Azonban ezeknek a nematicideknek az ismételt használata várhatóan szelekciós nyomást fog kiváltani, amely szinte biztosan rezisztens fenyőfonálférgák megjelenéséhez vezet, amint azt számos rovarkártevő esetében kimutatták, mint például a Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella és a Trichostrongylus colubriformis és Ostertagia circumcincta fonálférgek, amelyek fokozatosan rezisztensek10,10,10. Ezért a rezisztencia mintázatait rendszeresen tanulmányozni kell, és a nematocideket folyamatosan szűrni kell, hogy alternatív, költséghatékony és környezetbarát intézkedéseket találjanak a PVD elleni védekezésre. Az elmúlt évtizedekben számos szerző javasolta növényi kivonatok, illóolajok és illóanyagok fonálférgek elleni szerekként való használatát13,14,15,16.
A közelmúltban kimutattuk az indol, egy intercelluláris és interbirodalmi jelátviteli molekula nematicid hatását a Caenorhabditis elegansban 17 . Az indol egy széles körben elterjedt intracelluláris jel a mikrobiális ökológiában, számos olyan funkciót szabályoz, amelyek befolyásolják a mikrobiális fiziológiát, a spóraképzést, a plazmid stabilitását, a gyógyszerrezisztenciát, a biofilm képződést és a virulenciát18, 19. Az indol és származékai más patogén fonálférgekkel szembeni aktivitását nem vizsgálták. Ebben a vizsgálatban 34 indol fenyőfonálférgek elleni nematicid aktivitását vizsgáltuk, és mikroszkóppal, time-lapse fényképezéssel és molekuláris dokkolási kísérletekkel tisztáztuk a legerősebb 5-jód-indol hatásmechanizmusát, valamint magcsírázási vizsgálattal értékeltük a növényekre gyakorolt toxikus hatását.
Az indol magas koncentrációiról (>1,0 mM) korábban arról számoltak be, hogy nematocid hatást fejt ki a fonálférgekre17. A B. xylophilus (vegyes életszakasz) kezelését követően indollal vagy 33 különböző indolszármazékkal 1 mM koncentrációban, a B. xylophilus mortalitását élő és elpusztult fonálférgek megszámlálásával mértük a kontroll és a kezelt csoportban. Öt indol mutatott jelentős nematicid aktivitást; a kezeletlen kontrollcsoport túlélése 95 ± 7% volt 24 óra elteltével. A 34 vizsgált indol közül az 5-jód-indol és a 4-fluoroindol 1 mM koncentrációban 100%-os, míg az 5,6-difluoroindigo, a metil-indol-7-karboxilát és a 7-jód-indol körülbelül 50%-os mortalitást okozott (1. táblázat).
Az 5-jód-indol hatása a fenyőfa fonálféreg vakuólumképződésére és anyagcseréjére. (A) Az avermektin és az 5-jód-indol hatása kifejlett hím nematódákra, (B) L1 stádiumú fonálféreg tojásaira és (C) a B. xylophilus metabolizmusára, (i) vakuolákat nem figyeltek meg 0 órán belül, a kezelés eredménye (ii) vakuólumok, (iii) felhalmozódása, (iv) több vakuólum duzzanata, (iv) duzzanat vakuolák és (vi) óriási vakuólumok kialakulása. A piros nyilak a vakuolák duzzadását, a kék nyilak a vakuolák összeolvadását, a fekete nyilak pedig az óriási vakuolákat jelzik. Skálasáv = 50 μm.
Ezenkívül ez a tanulmány a fenyőfonálférgék metán által kiváltott halálának egymást követő folyamatát is leírta (4C. ábra). A metanogén halál a sejthalál nem apoptotikus típusa, amely a kiemelkedő citoplazmatikus vakuolák felhalmozódásához kapcsolódik27. Úgy tűnik, hogy a fenyőfonálférgeknél megfigyelt morfológiai hibák szorosan összefüggenek a metán által kiváltott halálozás mechanizmusával. Különböző időpontokban végzett mikroszkópos vizsgálat azt mutatta, hogy 20 órás 5-jód-indol (0,1 mM) expozíció után óriási vakuolák képződtek. A mikroszkópos vakuolákat 8 óra kezelés után figyeltük meg, számuk 12 óra múlva növekedett. 14 óra elteltével több nagy vakuólumot figyeltek meg. Számos összeolvadt vakuólum jól látható volt 12-16 órás kezelés után, ami azt jelzi, hogy a vakuólumfúzió a metanogén halálmechanizmus alapja. 20 óra elteltével több óriási vakuólumot találtak a féregben. Ezek a megfigyelések jelentik az első jelentést a C. elegans metuózisról.
Az 5-jód-indollal kezelt férgeknél vakuolák aggregációja és szakadása is megfigyelhető volt (5. ábra), amit a férgek elhajlása és a vakuólumok környezetbe való kibocsátása bizonyít. Vákuólumtörést figyeltek meg a tojáshéj membránjában is, amelyet az L2 általában sértetlenül megőrzött a keltetés során (kiegészítő S2 ábra). Ezek a megfigyelések alátámasztják a folyadék felhalmozódásának és az ozmoregulációs kudarcnak, valamint a reverzibilis sejtkárosodásnak (RCI) való részvételét a vakuólumok képződésében és gennyedésében (5. ábra).
Feltételezve a jód szerepét a megfigyelt vakuólumképzésben, a nátrium-jodid (NaI) és a kálium-jodid (KI) nematicid aktivitását vizsgáltuk. Azonban koncentrációkban (0,1, 0,5 vagy 1 mM) nem befolyásolták sem a fonálféreg túlélését, sem a vakuólumok kialakulását (S5 kiegészítő ábra), bár az 1 mM KI-nak enyhe nematicid hatása volt. Másrészt, a 7-jód-indol (1 vagy 2 mM), mint az 5-jód-indol, többszörös vakuolákat és szerkezeti deformációkat idézett elő (S6 kiegészítő ábra). A két jódoindol hasonló fenotípusos tulajdonságokat mutatott fenyőfonálférgekben, míg a NaI és a KI nem. Érdekes módon az indol nem indukált vakuólumképződést B. xylophilusban a vizsgált koncentrációkban (az adatokat nem mutatjuk be). Így az eredmények megerősítették, hogy az indol-jód komplex felelős a B. xylophilus vakuolizációjáért és metabolizmusáért.
A nematicid aktivitás szempontjából vizsgált indolok közül az 5-jódoindolnak volt a legmagasabb csúszási indexe -5,89 kcal/mol, ezt követi a 7-jódoindol (-4,48 kcal/mol), a 4-fluoroindol (-4,33) és az indol (-4,03) (6. ábra). Az 5-jód-indol erős gerincű hidrogénkötése a 218-as leucinhoz stabilizálja kötődését, míg az összes többi indolszármazék oldallánc hidrogénkötéseken keresztül kötődik a 260-as szerinhez. Más modellezett jód-indolok közül a 2-jód-indol kötési értéke -5,248 kcal/mol, ami a leucinnal 218 kötött fő hidrogénkötésének köszönhető. Egyéb ismert kötések közé tartozik a 3-jód-indol (-4,3 kcal/mol), 4-jód-indol (-4,0 kcal/mol) és a 6-fluorindol (-6,0 kcal/mol). kcal/mol) (S8 kiegészítő ábra). A legtöbb halogénezett indol és maga az indol, az 5-jód-indol és a 2-jódoindol kivételével, kötést képez a 260-as szerinnel. Az a tény, hogy a hidrogénkötés a 218-as leucinnal hatékony receptor-ligandum kötődést jelez, amint azt az ivermektinnél megfigyelték (kiegészítő ábra, S7- és doindoindole-io). A 2-jód-indol az ivermektinhez hasonlóan a leucin 218-on keresztül szorosan kötődik a GluCL receptor aktív helyéhez (6. ábra és S8 kiegészítő ábra). Javasoljuk, hogy ez a kötődés szükséges a GluCL komplex nyitott pórusszerkezetének fenntartásához, és hogy szorosan kötődik a GluCL receptor aktív helyéhez, az 5-jód-indol, a 2-jód-indol, az avermektin és az ivermektin így nyitva tartsa az ioncsatornát és lehetővé teszi a folyadék felvételét.
Az indol és a halogénezett indol molekuláris dokkolása a GluCL-hez. Az (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-jódoindol és (D) 5-jód-indol ligandumok kötődése a GluCL aktív helyéhez. A fehérjét szalag képviseli, a gerinc hidrogénkötéseit pedig sárga szaggatott vonalak jelzik. (A'), (B'), (C') és (D') a megfelelő ligandumok és a környező aminosavmaradékok kölcsönhatásait mutatják, az oldallánc hidrogénkötéseit pedig rózsaszín pontozott nyilak jelzik.
Kísérleteket végeztek az 5-jód-indol káposzta- és retekmagok csírázására gyakorolt toxikus hatásának értékelésére. Az 5-jód-indol (0,05 vagy 0,1 mM) vagy az avermektin (10 μg/ml) csekély vagy egyáltalán nem befolyásolta a kezdeti csírázást és a növények kikelését (7. ábra). Ezenkívül nem találtunk szignifikáns különbséget a kezeletlen kontrollok és az 5-jód-indollal vagy avermektinnel kezelt magvak csírázási sebessége között. A karógyökér megnyúlására és a kialakult oldalgyökerek számára gyakorolt hatás jelentéktelen volt, bár 1 mM (aktív koncentrációjának 10-szerese) 5-jód-indol kismértékben késleltette az oldalgyökerek fejlődését. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 5-jód-indol nem toxikus a növényi sejtekre, és nem zavarja a növény fejlődési folyamatait a vizsgált koncentrációkban.
Az 5-jód-indol hatása a vetőmag csírázására. A B. oleracea és R. raphanistrum magvak csírázása, csírázása és oldalirányú gyökerezése Murashige és Skoog agar táptalajon avermektinnel vagy 5-jód-indollal vagy anélkül. A csírázást 3 napos, 22 °C-on történő inkubálás után regisztráltuk.
Ez a tanulmány több olyan esetről számol be, amikor az indolok fonálférgeket pusztítottak el. Fontos, hogy ez az első jelentés arról, hogy a jód-indol metilációt indukál (ez a folyamat, amelyet a kis vakuólumok felhalmozódása okoz, amelyek fokozatosan hatalmas vakuólumokká egyesülnek, és végül membránrepedéshez és elhaláshoz vezetnek) a fenyőtűkben, és a jód-indol jelentős nematicid tulajdonságokat mutat, amelyek hasonlóak a kereskedelmi nematicid averm nematicid tulajdonságaihoz.
Korábban kimutatták, hogy az indolok többféle jelátviteli funkciót töltenek be prokariótákban és eukariótákban, beleértve a biofilm gátlását/képződését, a baktériumok túlélését és a patogenitást19,32,33,34. Az utóbbi időben a halogénezett indolok, indol-alkaloidok és félszintetikus indol-származékok potenciális terápiás hatásai széleskörű kutatási érdeklődést keltettek35,36,37. Például kimutatták, hogy a halogénezett indolok elpusztítják a perzisztens Escherichia coli és Staphylococcus aureus sejteket37. Ezenkívül tudományos szempontból is érdekes a halogénezett indolok más fajokkal, nemzetségekkel és királyságokkal szembeni hatékonyságának vizsgálata, és ez a tanulmány egy lépés e cél elérése felé.
Itt egy olyan mechanizmust javasolunk az 5-jód-indol által kiváltott letalitásra C. elegansban, amely reverzibilis sejtkárosodáson (RCI) és metiláción alapul (4C. és 5. ábra). Az ödémás elváltozások, például a puffadtság és a vakuoláris degeneráció az RCI és a metiláció indikátorai, amelyek a citoplazmában óriási vakuólumokban nyilvánulnak meg48,49. Az RCI megzavarja az energiatermelést azáltal, hogy csökkenti az ATP-termelést, az ATPáz pumpa meghibásodását okozza, vagy megzavarja a sejtmembránokat, és gyors Na+-, Ca2+- és vízbeáramlást okoz50,51,52. Az állati sejtekben intracitoplazmatikus vakuolák keletkeznek a citoplazmában a Ca2+ és a víz beáramlása miatti folyadék felhalmozódása következtében53. Érdekes módon a sejtkárosodásnak ez a mechanizmusa visszafordítható, ha a károsodás átmeneti, és a sejtek egy bizonyos ideig elkezdenek ATP-t termelni, de ha a károsodás továbbra is fennáll vagy súlyosbodik, a sejtek elpusztulnak.54 Megfigyeléseink azt mutatják, hogy az 5-jód-indollal kezelt fonálférgek nem képesek visszaállítani a normál bioszintézist stressz körülményeknek való kitettség után.
A B. xylophilusban az 5-jódoindol által kiváltott metilációs fenotípus a jód jelenlétének és molekuláris eloszlásának tudható be, mivel a 7-jódoindol kevésbé gátló hatással volt a B. xylophilusra, mint az 5-jódoindol (1. táblázat és S6 kiegészítő ábra). Ezek az eredmények részben összhangban vannak Maltese és munkatársai tanulmányaival. (2014), akik arról számoltak be, hogy az indolban lévő piridil-nitrogénrész transzlokációja a para-helyzetből a metapozícióba megszüntette a vakuolizációt, a növekedés gátlását és a citotoxicitást az U251 sejtekben, ami arra utal, hogy a molekula kölcsönhatása a fehérje egy specifikus aktív helyével kritikus 27, 44, 45. A tanulmányban megfigyelt indol vagy halogénezett indolok és a GluCL receptorok közötti kölcsönhatások is alátámasztják ezt az elképzelést, mivel az 5- és 2-jód-indol erősebben kötődik a GluCL receptorokhoz, mint a többi vizsgált indol (6. ábra és S8 kiegészítő ábra). Azt találták, hogy az indol második vagy ötödik pozíciójában lévő jód a GluCL-receptor 218-as leucinjához kötődik a gerinc hidrogénkötésein keresztül, míg más halogénezett indolok és maga az indol gyenge oldalláncú hidrogénkötést képez a 260-as szerinnel (6. ábra). Ezért feltételezzük, hogy a halogén lokalizációja fontos szerepet játszik a vakuoláris degeneráció kiváltásában, míg az 5-jód-indol szoros kötődése nyitva tartja az ioncsatornát, ezáltal lehetővé teszi a gyors folyadék beáramlást és a vakuólum felszakadását. Az 5-jód-indol részletes hatásmechanizmusa azonban még meghatározásra vár.
Az 5-jód-indol gyakorlati alkalmazása előtt elemezni kell a növényekre gyakorolt toxikus hatását. Magcsírázási kísérleteink azt mutatták, hogy az 5-jód-indol a vizsgált koncentrációk mellett nem gyakorolt negatív hatást a magok csírázására vagy a későbbi fejlődési folyamatokra (7. ábra). Így ez a tanulmány alapot ad az 5-jód-indol ökológiai környezetben való felhasználásához a fenyőfonálférgák fenyőfákra gyakorolt káros hatásának szabályozására.
Korábbi jelentések kimutatták, hogy az indol-alapú terápia potenciális megközelítést jelent az antibiotikum-rezisztencia és a rák progressziójának kezelésére55. Ezenkívül az indolok antibakteriális, rákellenes, antioxidáns, gyulladáscsökkentő, antidiabetikus, vírusellenes, antiproliferatív és tuberkulózis elleni hatással is rendelkeznek, és ígéretes alapként szolgálhatnak a gyógyszerfejlesztésben56,57. Ez a tanulmány először javasolja a jód parazita- és féregellenes szerként való lehetséges alkalmazását.
Az avermektint három évtizede fedezték fel, és 2015-ben Nobel-díjat nyert, és féreghajtóként való alkalmazása még mindig aktívan folyik. A nematódák és rovarkártevők avermektinekkel szembeni rezisztenciájának gyors fejlődése miatt azonban alternatív, alacsony költségű és környezetbarát stratégiára van szükség a fenyőfák fenyőfa fertőzésének leküzdésére. Ez a tanulmány beszámol arról a mechanizmusról is, amellyel az 5-jód-indol elpusztítja a fenyőfonálférgeket, és hogy az 5-jód-indol alacsony toxicitású a növényi sejtekre, ami jó kilátásokat nyit jövőbeli kereskedelmi alkalmazására.
Minden kísérletet jóváhagyott a Yeungnam Egyetem Etikai Bizottsága, Gyeongsan, Korea, és a módszereket a Yeungnam Egyetem Etikai Bizottsága irányelveinek megfelelően végezték.
A tojáskeltetési kísérleteket bevált eljárásokkal43 végeztük. A kikelés arányának (HR) meghatározásához 1 napos kifejlett fonálférgeket (körülbelül 100 nőstény és 100 hím) áthelyeztünk a gombát tartalmazó Petri-csészékbe, és 24 órán át hagytuk növekedni. A tojásokat ezután izoláltuk, és 5-jód-indollal (0,05 mM és 0,1 mM) vagy avermektinnel (10 μg/ml) kezeltük steril desztillált vízben készült szuszpenzió formájában. Ezeket a szuszpenziókat (500 μl; körülbelül 100 tojás) egy 24 lyukú szövettenyésztő lemez lyukaiba vittük, és 22 °C-on inkubáltuk. Az L2-számlálást 24 órás inkubáció után végeztük, de elhaltaknak tekintették, ha a sejtek nem mozdultak el, amikor finom platinahuzallal stimulálták. Ezt a kísérletet két szakaszban végezték, mindegyik hat ismétléssel. A két kísérlet adatait egyesítettük és bemutattuk. A HR százalékos kiszámítása a következőképpen történik:
A lárvák mortalitását korábban kidolgozott eljárásokkal értékelték. A fonálféreg tojásait összegyűjtöttük, és az embriókat steril desztillált vízben való keltetéssel szinkronizáltuk, hogy L2 stádiumú lárvákat hozzunk létre. A szinkronizált lárvákat (körülbelül 500 fonálféreg) 5-jód-indollal (0,05 mM és 0,1 mM) vagy avermektinnel (10 μg/ml) kezeltük, és B. cinerea Petri lemezeken neveltük fel. 48 órás, 22 °C-on történő inkubálás után a fonálférgeket steril desztillált vízben gyűjtöttük össze, és megvizsgáltuk az L2, L3 és L4 stádiumok jelenlétét. Az L3 és L4 stádium jelenléte lárvatranszformációra utalt, míg az L2 stádium jelenléte nem jelzett átalakulást. A képek az iRiS™ Digital Cell Imaging System segítségével készültek. Ezt a kísérletet két szakaszban végezték, mindegyik hat ismétléssel. A két kísérlet adatait egyesítettük és bemutattuk.
Az 5-jód-indol és az avermektin magvakra gyakorolt toxicitását csírázási tesztekkel határoztuk meg Murashige és Skoog agar lemezeken.62 B. oleracea és R. raphanistrum magvakat először steril desztillált vízben áztattunk egy napig, majd 1 ml 100%-os etanollal, 100%-os etanollal, 10,50 ml 1,50 ml-es sterilizálással mostuk. hipoklorit) 15 percig, és ötször mossuk 1 ml steril vízzel. A sterilizált magokat ezután csíráztató agar lemezekre préseltük, amelyek 0,86 g/l (0,2X) Murashige és Skoog táptalajt és 0,7% bakteriológiai agart tartalmaztak 5-jód-indollal vagy avermektinnel vagy anélkül. A lemezeket ezután 22 °C-on inkubáltuk, és 3 napos inkubáció után képeket készítettünk. Ezt a kísérletet két szakaszban végezték, amelyek mindegyike hat ismétlésből állt.
Feladás időpontja: 2025.02.26