A fenyőfonálféreg egy karantén vándorló endoparazita, amelyről ismert, hogy súlyos gazdasági veszteségeket okoz a fenyvesek ökoszisztémáiban. A jelen tanulmány a halogénezett indolok fenyőfonálférgek elleni fonálféreg-ölő aktivitását és hatásmechanizmusát tekinti át. Az 5-jód-indol és az avermektin (pozitív kontroll) fenyőfonálférgek elleni fonálféreg-ölő aktivitása hasonló és alacsony koncentrációban (10 μg/ml) magas volt. Az 5-jód-indol csökkentette a termékenységet, a reprodukciós aktivitást, az embrionális és lárvahalandóságot, valamint a mozgásszervi viselkedést. A ligandumok és a gerinctelen-specifikus glutamátfüggő kloridcsatorna-receptorok molekuláris kölcsönhatásai alátámasztják azt az elképzelést, hogy az 5-jód-indol, az avermektinhez hasonlóan, szorosan kötődik a receptor aktív helyéhez. Az 5-jód-indol különféle fenotípusos deformációkat is kiváltott a fonálférgekben, beleértve a rendellenes szervösszeomlást/zsugorodást és a fokozott vakuolizációt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a vakuólumok szerepet játszhatnak a fonálféreg-metiláció által közvetített halálban. Fontos megjegyezni, hogy az 5-jód-indol nem volt toxikus mindkét növényfajra (káposzta és retek). Így ez a tanulmány bizonyítja, hogy a jód-indol alkalmazása környezeti feltételek mellett képes szabályozni a fenyő hervadásának károsodását.
A fenyőfa-fonálféreg (Bursaphelenchus xylophilus) a fenyőfa-fonálférgek (PWN) családjába tartozik, amelyekről ismert, hogy súlyos ökológiai károkat okoznak a fenyvesek ökoszisztémáiban1. A fenyőfa-fonálféreg által okozott fenyőhervadásbetegség (PWD) számos kontinensen, köztük Ázsiában és Európában is komoly problémává válik, Észak-Amerikában pedig a fonálféreg elpusztítja a betelepített fenyőfajokat1,2. A fenyőfák pusztulása jelentős gazdasági probléma, és globális elterjedésének kilátásai aggasztóak3. A következő fenyőfajokat támadja meg leggyakrabban a fonálféreg: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii és Pinus radiata4. A fenyőfonálféreg egy súlyos betegség, amely a fertőzést követő heteken vagy hónapokon belül elpusztíthatja a fenyőfákat. Ezenkívül a fenyőfonálféreg-járványok gyakoriak számos ökoszisztémában, így tartós fertőzési láncok alakultak ki1.
A Bursaphelenchus xylophilus egy karantén növényi parazita fonálféreg, amely az Aphelenchoidea szupercsaládba és a 102.5 kládba tartozik. A fonálféreg gombákkal táplálkozik, és a fenyőfák faanyagszöveteiben szaporodik, négy különböző lárvaállapotba fejlődve: L1, L2, L3, L4 és egy kifejlett egyed1,6. Táplálékhiány esetén a fenyőfonálféreg egy specializált lárvaállapotba – dauerbe – megy át, amely parazitálja vektorát – a fenyőkéreg-szút (Monochamus alternatus) –, és átkerül az egészséges fenyőfákra. Egészséges gazdaszervezetben a fonálférgek gyorsan átvándorolnak a növényi szöveteken, és a parenchimás sejtekkel táplálkoznak, ami számos túlérzékenységi reakcióhoz, a fenyő hervadásához és a fertőzést követő egy éven belüli pusztuláshoz vezet1,7,8.
A fenyőfonálférgek biológiai irtása régóta kihívást jelent, a karanténintézkedések egészen a 20. századig nyúlnak vissza. A fenyőfonálférgek elleni védekezés jelenlegi stratégiái elsősorban kémiai kezeléseket foglalnak magukban, beleértve a fa füstölését és a fonálférgek irtásának szerek fatörzsekbe történő beültetését. A leggyakrabban használt fonálférgek az avermektin és az avermektin-benzoát, amelyek az avermektinek családjába tartoznak. Ezek a drága vegyszerek rendkívül hatékonyak számos fonálféregfaj ellen, és környezetileg biztonságosnak tekinthetők9. Ezen fonálférgek ismételt használata azonban várhatóan szelekciós nyomást gyakorol, ami szinte biztosan rezisztens fenyőfonálférgek megjelenéséhez vezet, amint azt számos rovarkártevő, például a Leptinotarsa decemlineata, a Plutella xylostella, valamint a Trichostrongylus colubriformis és az Ostertagia circumcincta fonálférgek esetében kimutatták, amelyek fokozatosan fejlesztették ki az avermektinekkel szembeni rezisztenciát10,11,12. Ezért a rezisztenciamintákat rendszeresen tanulmányozni kell, és a fonálférgek irtását folyamatosan szűrni kell, hogy alternatív, költséghatékony és környezetbarát intézkedéseket találjunk a PVD leküzdésére. Az elmúlt évtizedekben számos szerző javasolta növényi kivonatok, illóolajok és illékony anyagok fonálférgek elleni védekezésben való alkalmazását13,14,15,16.
Nemrégiben kimutattuk az indol, egy sejtek közötti és királyságok közötti jelátviteli molekula fonálféreg-ölő aktivitását Caenorhabditis elegans-ban 17. Az indol egy széles körben elterjedt intracelluláris jelátviteli molekula a mikrobiális ökológiában, számos olyan funkciót szabályoz, amelyek befolyásolják a mikrobiális fiziológiát, a spóraképződést, a plazmid stabilitását, a gyógyszerrezisztenciát, a biofilmképződést és a virulenciát 18, 19. Az indol és származékainak más patogén fonálférgek elleni aktivitását még nem vizsgálták. Ebben a tanulmányban 34 indol fonálférgek elleni fonálférgek elleni aktivitását vizsgáltuk, és mikroszkópia, időzített fényképezés és molekuláris dokkolási kísérletek segítségével tisztáztuk a legerősebb 5-jódindol hatásmechanizmusát, valamint magcsírázási vizsgálattal értékeltük a növényekre gyakorolt toxikus hatásait.
Korábban kimutatták, hogy az indol magas koncentrációban (>1,0 mM) fonálféreg-ölő hatást fejt ki a fonálférgekre17. A B. xylophilus (vegyes életszakasz) 1 mM-os indollal vagy 33 különböző indolszármazékkal történő kezelését követően a B. xylophilus mortalitását a kontroll- és kezelt csoportokban élő és elpusztult fonálférgek számlálásával mérték. Öt indol mutatott jelentős fonálféreg-ölő aktivitást; a kezeletlen kontrollcsoport túlélése 24 óra elteltével 95 ± 7% volt. A 34 vizsgált indol közül az 5-jód-indol és a 4-fluor-indol 1 mM-os koncentrációban 100%-os mortalitást okozott, míg az 5,6-difluor-indigó, a metil-indol-7-karboxilát és a 7-jód-indol körülbelül 50%-os mortalitást okozott (1. táblázat).
Az 5-jód-indol hatása a fenyőfa fonálféreg vakuólumképződésére és anyagcseréjére. (A) Az avermektin és az 5-jód-indol hatása kifejlett hím fonálférgekre, (B) L1 stádiumú fonálféreg peték és (C) a B. xylophilus anyagcseréje, (i) 0 óránál nem figyeltek meg vakuólumokat, a kezelés (ii) vakuólumokat, (iii) több vakuólum felhalmozódását, (iv) a vakuólumok duzzadását, (v) a vakuólumok fúzióját és (vi) óriás vakuólumok kialakulását eredményezte. A piros nyilak a vakuólumok duzzadását, a kék nyilak a vakuólumok fúzióját, a fekete nyilak pedig az óriás vakuólumokat jelzik. Lépték = 50 μm.
Ezenkívül ez a tanulmány a fenyőfonálférgek metán által kiváltott pusztulásának szekvenciális folyamatát is leírta (4C. ábra). A metanogén pusztulás a sejthalál nem apoptotikus típusa, amely kiemelkedő citoplazmatikus vakuólumok felhalmozódásához kapcsolódik27. A fenyőfonálférgeknél megfigyelt morfológiai hibák szorosan összefüggenek a metán által kiváltott pusztulás mechanizmusával. Különböző időpontokban végzett mikroszkópos vizsgálat kimutatta, hogy óriás vakuólumok alakultak ki 20 órás 5-jódindol (0,1 mM) kezelés után. 8 órás kezelés után mikroszkopikus vakuólumokat figyeltek meg, amelyek számuk 12 óra elteltével megnőtt. 14 óra elteltével több nagy vakuólumot figyeltek meg. 12-16 órás kezelés után több összeolvadt vakuólum volt jól látható, ami arra utal, hogy a vakuólumok fúziója a metanogén pusztulás mechanizmusának alapja. 20 óra elteltével több óriás vakuólumot találtak a féregben. Ezek a megfigyelések a metoózis első beszámolói a C. elegans-ban.
Az 5-jódindollal kezelt férgekben vakuólum-aggregációt és -repedést is megfigyeltek (5. ábra), amit a férgek meghajlása és a vakuólumok környezetbe történő kijutása is bizonyít. Vakuólum-felszakadást figyeltek meg a tojáshéj membránjában is, amelyet a kikelés során az L2 normális esetben épségben megőrz (S2. kiegészítő ábra). Ezek a megfigyelések alátámasztják a folyadékfelhalmozódás és az ozmoregulációs zavar, valamint a reverzibilis sejtkárosodás (RCI) szerepét a vakuólumképződés és -gennyedés folyamatában (5. ábra).
A jód megfigyelt vakuólumképződésben betöltött szerepét feltételezve megvizsgáltuk a nátrium-jodid (NaI) és a kálium-jodid (KI) nematocid aktivitását. Azonban koncentrációkban (0,1, 0,5 vagy 1 mM) ezek nem befolyásolták sem a fonálférgek túlélését, sem a vakuólumképződést (S5. kiegészítő ábra), bár az 1 mM KI enyhe nematocid hatást mutatott. Másrészt a 7-jód-indol (1 vagy 2 mM), az 5-jód-indolhoz hasonlóan, többszörös vakuólumokat és szerkezeti deformációkat indukált (S6. kiegészítő ábra). A két jód-indol hasonló fenotípusos jellemzőket mutatott a fenyő fonálférgekben, míg a NaI és a KI nem. Érdekes módon az indol nem indukált vakuólumképződést a B. xylophilusban a vizsgált koncentrációkban (az adatokat nem mutatjuk be). Így az eredmények megerősítették, hogy az indol-jód komplex felelős a B. xylophilus vakuolizációjáért és metabolizmusáért.
A nematocid aktivitás szempontjából tesztelt indolok közül az 5-jód-indol rendelkezett a legmagasabb csúszási indexszel, -5,89 kcal/mol-lal, ezt követte a 7-jód-indol (-4,48 kcal/mol), a 4-fluor-indol (-4,33) és az indol (-4,03) (6. ábra). Az 5-jód-indol erős gerinclánc-hidrogénkötése a 218-as leucinhoz stabilizálja annak kötődését, míg az összes többi indolszármazék oldallánc-hidrogénkötéseken keresztül kötődik a 260-as szerinhez. Más modellezett jód-indolok közül a 2-jód-indol kötődési értéke -5,248 kcal/mol, ami a 218-as leucinnal való fő hidrogénkötésének köszönhető. Egyéb ismert kötődések közé tartozik a 3-jód-indol (-4,3 kcal/mol), a 4-jód-indol (-4,0 kcal/mol) és a 6-fluor-indol (-2,6 kcal/mol) (S8. kiegészítő ábra). A legtöbb halogénezett indol és maga az indol is, az 5-jód-indol és a 2-jód-indol kivételével, kötést képez a 260-as szerinnel. Az a tény, hogy a leucinnal 218 hidrogénkötés alakul ki, a hatékony receptor-ligand kötődésre utal, amint azt az ivermektin esetében is megfigyelték (S7. kiegészítő ábra), megerősíti, hogy az 5-jód-indol és a 2-jód-indol, az ivermektinhez hasonlóan, szorosan kötődik a GluCL receptor aktív helyéhez a 218-as leucinon keresztül (6. ábra és S8. kiegészítő ábra). Azt feltételezzük, hogy ez a kötődés szükséges a GluCL komplex nyitott pórusszerkezetének fenntartásához, és hogy a GluCL receptor aktív helyéhez való szoros kötődéssel az 5-jód-indol, a 2-jód-indol, az avermektin és az ivermektin így nyitva tartja az ioncsatornát, és lehetővé teszi a folyadékfelvételt.
Indol és halogénezett indol molekuláris dokkolása GluCL-hez. Az (A) indol, (B) 4-fluorindol, (C) 7-jódindol és (D) 5-jódindol ligandumok kötődési orientációi a GluCL aktív helyéhez. A fehérjét egy szalag ábrázolja, a gerinc hidrogénkötéseit pedig sárga szaggatott vonalak mutatják. Az (A′), (B′), (C′) és (D′) a megfelelő ligandumok kölcsönhatásait mutatják a környező aminosavmaradékokkal, az oldalláncok hidrogénkötéseit pedig rózsaszín szaggatott nyilak jelzik.
Kísérleteket végeztek az 5-jód-indol káposzta- és retekmagok csírázására gyakorolt toxikus hatásának értékelésére. Az 5-jód-indol (0,05 vagy 0,1 mM) vagy az avermektin (10 μg/ml) csekély vagy semmilyen hatással nem volt a kezdeti csírázásra és a növénykék kelésére (7. ábra). Ezenkívül nem találtak szignifikáns különbséget a kezeletlen kontrollok és az 5-jód-indollal vagy avermektinnel kezelt magok csírázási aránya között. A karógyökér megnyúlására és a képződött oldalgyökerek számára gyakorolt hatás jelentéktelen volt, bár 1 mM (a hatóanyag koncentrációjának tízszerese) 5-jód-indol kismértékben késleltette az oldalgyökerek fejlődését. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 5-jód-indol nem toxikus a növényi sejtekre, és a vizsgált koncentrációkban nem zavarja a növény fejlődési folyamatait.
Az 5-jód-indol hatása a magok csírázására. A B. oleracea és R. raphanistrum magok csírázása, kihajtása és oldalirányú gyökeresedése Murashige és Skoog agar táptalajon, avermektinnel vagy 5-jód-indollal vagy anélkül. A csírázást 3 napos, 22°C-on történő inkubálás után mérték.
Ez a tanulmány számos olyan esetről számol be, amikor indolok irtották a fonálférgeket. Fontos megjegyezni, hogy ez az első olyan eset, amikor a jód-indol metilációt indukál (ezt a folyamatot kis vakuólumok felhalmozódása okozza, amelyek fokozatosan óriási vakuólumokká egyesülnek, végül a membrán megrepedéséhez és pusztulásához vezetnek) fenyőtűkben, ahol a jód-indol jelentős fonálféreg-ölő tulajdonságokat mutat, hasonlóan a kereskedelmi forgalomban kapható avermektin fonálféreg-ölő szerekhez.
Korábban kimutatták, hogy az indolok többféle jelátviteli funkciót töltenek be prokariótákban és eukariótákban, beleértve a biofilm gátlását/képződését, a baktériumok túlélését és a patogenitást19,32,33,34. Az utóbbi időben a halogénezett indolok, indol-alkaloidok és félszintetikus indol-származékok potenciális terápiás hatásai széleskörű kutatási érdeklődést keltettek35,36,37. Például kimutatták, hogy a halogénezett indolok elpusztítják a perzisztens Escherichia coli és Staphylococcus aureus sejteket37. Ezenkívül tudományos szempontból is érdekes a halogénezett indolok más fajokkal, nemzetségekkel és királyságokkal szembeni hatékonyságának vizsgálata, és ez a tanulmány egy lépés e cél elérése felé.
Jelen tanulmányban egy mechanizmust javaslunk az 5-jód-indol által kiváltott letalitásra a C. elegans-ban, amely a reverzibilis sejtkárosodáson (RCI) és a metiláción alapul (4C. és 5. ábra). Az ödémás változások, mint például a puffadás és a vakuoláris degeneráció, az RCI és a metiláció indikátorai, amelyek óriási vakuólumokként jelentkeznek a citoplazmában48,49. Az RCI az ATP-termelés csökkentésével, az ATPáz pumpa meghibásodásával, vagy a sejtmembránok megbontásával és a Na+, Ca2+ és víz gyors beáramlásával zavarja az energiatermelést50,51,52. Az intracitoplazmatikus vakuólumok az állati sejtekben a citoplazmában a Ca2+ és víz beáramlása miatti folyadékfelhalmozódás eredményeként keletkeznek53. Érdekes módon a sejtkárosodásnak ez a mechanizmusa reverzibilis, ha a károsodás átmeneti, és a sejtek egy bizonyos ideig ATP-t kezdenek termelni, de ha a károsodás továbbra is fennáll vagy súlyosbodik, a sejtek elpusztulnak.54 Megfigyeléseink azt mutatják, hogy az 5-jód-indollal kezelt fonálférgek nem képesek helyreállítani a normális bioszintézist stressz körülmények között.
Az 5-jód-indol által a B. xylophilusban kiváltott metilációs fenotípus a jód jelenlétének és molekuláris eloszlásának tudható be, mivel a 7-jód-indolnak kisebb gátló hatása volt a B. xylophilusra, mint az 5-jód-indol (1. táblázat és S6. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények részben összhangban vannak Maltese és munkatársai (2014) tanulmányaival, akik arról számoltak be, hogy az indol piridil-nitrogénrészének a para-helyzetből a meta-helyzetbe történő transzlokációja megszüntette a vakuolizációt, a növekedésgátlást és a citotoxicitást az U251 sejtekben, ami arra utal, hogy a molekula kölcsönhatása a fehérje egy specifikus aktív helyével kritikus27,44,45. Az indol vagy halogénezett indolok és a GluCL receptorok között ebben a vizsgálatban megfigyelt kölcsönhatások is alátámasztják ezt a feltételezést, mivel az 5- és 2-jód-indol erősebben kötődött a GluCL receptorokhoz, mint a többi vizsgált indol (6. ábra és S8. kiegészítő ábra). Az indol második vagy ötödik pozíciójában lévő jód a GluCL receptor 218-as leucinjához kötődik gerinclánc-hidrogénkötéseken keresztül, míg más halogénezett indolok és maga az indol is gyenge oldallánc-hidrogénkötéseket képez a 260-as szerinnel (6. ábra). Ezért feltételezzük, hogy a halogén lokalizációja fontos szerepet játszik a vakuoláris degeneráció kiváltásában, míg az 5-jód-indol szoros kötődése nyitva tartja az ioncsatornát, ezáltal lehetővé téve a gyors folyadékbeáramlást és a vakuólumok felrepedését. Az 5-jód-indol részletes hatásmechanizmusa azonban még meghatározásra vár.
Az 5-jód-indol gyakorlati alkalmazása előtt elemezni kell a növényekre gyakorolt toxikus hatását. Vetőmagcsíráztatási kísérleteink azt mutatták, hogy az 5-jód-indol a vizsgált koncentrációkban nem befolyásolta negatívan a magcsírázást vagy a későbbi fejlődési folyamatokat (7. ábra). Így ez a tanulmány alapot teremt az 5-jód-indol ökológiai környezetben történő alkalmazására a fenyőfonálférgek fenyőfákra gyakorolt káros hatásának szabályozására.
Korábbi jelentések kimutatták, hogy az indol alapú terápia potenciális megközelítést jelent az antibiotikum-rezisztencia és a rák progressziójának problémájának kezelésére55. Ezenkívül az indolok antibakteriális, rákellenes, antioxidáns, gyulladáscsökkentő, antidiabetikus, antivirális, antiproliferatív és antituberkulózis hatásúak, és ígéretes alapul szolgálhatnak a gyógyszerfejlesztéshez56,57. Ez a tanulmány elsőként javasolja a jód potenciális alkalmazását parazitaellenes és féreghajtó szerként.
Az avermektint három évtizeddel ezelőtt fedezték fel, és 2015-ben Nobel-díjat nyert érte, féreghajtóként való alkalmazása pedig továbbra is aktív. Azonban a fonálférgek és rovarkártevők avermektinekkel szembeni rezisztenciájának gyors kialakulása miatt alternatív, alacsony költségű és környezetbarát stratégiára van szükség a fenyőfák fenyőfonálféreg-fertőzésének leküzdésére. Ez a tanulmány azt a mechanizmust is ismerteti, amellyel az 5-jódindol elpusztítja a fenyőfonálférgeket, és hogy az 5-jódindol alacsony toxicitású a növényi sejtekre, ami jó lehetőségeket nyit a jövőbeni kereskedelmi alkalmazása előtt.
Minden kísérletet a Yeungnam Egyetem (Gyeongsan, Korea) Etikai Bizottsága hagyott jóvá, és a módszereket a Yeungnam Egyetem Etikai Bizottságának irányelveivel összhangban végezték.
A tojáskeltetési kísérleteket bevált eljárások43 szerint végezték. A kikelési arány (HR) felméréséhez 1 napos kifejlett fonálférgeket (körülbelül 100 nőstény és 100 hím) helyeztek át a gombát tartalmazó Petri-csészékbe, és 24 órán át hagyták növekedni. A petéket ezután izolálták, és 5-jódindollal (0,05 mM és 0,1 mM) vagy avermektinnel (10 μg/ml) kezelték steril desztillált vízben szuszpendálva. Ezeket a szuszpenziókat (500 μl; körülbelül 100 pete) egy 24-lyukú szövettenyésztő lemez lyukaiba helyezték, és 22 °C-on inkubálták. Az L2 számlálást 24 óra inkubáció után végezték, de a sejteket elpusztultnak tekintették, ha a sejtek nem mozdultak el finom platinadróttal történő stimulációra. A kísérletet két szakaszban végezték, mindegyiket hat ismétléssel. Mindkét kísérlet adatait összevonták és bemutatták. A HR százalékos arányát a következőképpen számították ki:
A lárvahalandóságot korábban kidolgozott eljárásokkal értékelték. A fonálférgek petéit összegyűjtötték, és az embriókat steril desztillált vízben kikeléssel szinkronizálták, hogy L2 stádiumú lárvákat hozzanak létre. A szinkronizált lárvákat (körülbelül 500 fonálféreg) 5-jódindollal (0,05 mM és 0,1 mM) vagy avermektinnel (10 μg/ml) kezelték, és B. cinerea Petri-lemezeken nevelték. 48 órás, 22 °C-on történő inkubálás után a fonálférgeket steril desztillált vízben összegyűjtötték, és megvizsgálták az L2, L3 és L4 stádiumok jelenlétét. Az L3 és L4 stádiumok jelenléte lárvaátalakulást jelzett, míg az L2 stádium jelenléte nem utalt átalakulásra. A képeket az iRiS™ digitális sejtképalkotó rendszerrel készítették. Ez a kísérlet két szakaszban történt, mindegyiket hat ismétléssel. Mindkét kísérletből származó adatokat összevonták és bemutatták.
Az 5-jód-indol és az avermektin magvakra gyakorolt toxicitását Murashige és Skoog agar lemezeken végzett csírázási tesztekkel értékelték.62 A B. oleracea és R. raphanistrum magokat először egy napig steril desztillált vízben áztatták, 1 ml 100%-os etanollal mosták, 1 ml 50%-os kereskedelmi forgalomban kapható fehérítővel (3% nátrium-hipoklorit) sterilizálták 15 percig, majd ötször mosták 1 ml steril vízzel. A sterilizált magokat ezután 0,86 g/l (0,2X) Murashige és Skoog táptalajt és 0,7%-os bakteriológiai agart tartalmazó csíráztató agar lemezekre préselték, 5-jód-indol vagy avermektin jelenlétében vagy hiányában. A lemezeket ezután 22 °C-on inkubálták, és 3 napos inkubáció után képeket készítettek. A kísérletet két szakaszban végezték, mindegyik szakasz hat ismétlést tartalmazott.
Közzététel ideje: 2025. február 26.