Ez a tanulmány a kereskedelmi forgalomban kapható gyógyszerek letalitását, szubletalitását és toxicitását vizsgálta.cipermetrinkészítmények hatását az anurán ebihalakra. Az akut tesztben 100–800 μg/l koncentrációkat teszteltek 96 órán át. A krónikus tesztben a természetesen előforduló cipermetrin koncentrációkat (1, 3, 6 és 20 μg/l) vizsgálták mortalitás szempontjából, majd 7 napon keresztül mikronukleusz-vizsgálatot és vörösvérsejt-magrendellenességeket vizsgáltak. A kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmény LC50 értéke ebihalakra 273,41 μg L−1 volt. A krónikus tesztben a legmagasabb koncentráció (20 μg L−1) több mint 50%-os mortalitást eredményezett, mivel a vizsgált ebihalak felét elpusztította. A mikronukleusz-teszt szignifikáns eredményeket mutatott 6 és 20 μg L−1 koncentrációban, és számos nukleáris rendellenességet észleltek, ami arra utal, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmény genotoxikus potenciállal rendelkezik a P. gracilis ellen. A cipermetrin nagy kockázatot jelent erre a fajra, ami arra utal, hogy több problémát is okozhat, és rövid és hosszú távon is befolyásolhatja az ökoszisztéma dinamikáját. Ezért arra a következtetésre juthatunk, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmények toxikus hatással vannak a P. gracilisre.
A mezőgazdasági tevékenységek folyamatos bővülése és az intenzív alkalmazás miattkártevőirtásAz intézkedések miatt a vízi állatok gyakran ki vannak téve a növényvédő szereknek1,2. A mezőgazdasági területek közelében lévő vízkészletek szennyezése befolyásolhatja a nem célzott élőlények, például a kétéltűek fejlődését és túlélését.
A kétéltűek egyre nagyobb jelentőségre tesznek szert a környezeti mátrixok értékelésében. Az anuránokat a környezeti szennyező anyagok jó bioindikátorainak tekintik olyan egyedi jellemzőik miatt, mint az összetett életciklusok, a gyors lárvanövekedési ütem, a trofikus állapot, az áteresztő bőr10,11, a szaporodáshoz szükséges víztől való függés12 és a védtelen peték11,13,14. A kis vízibéka (Physalaemus gracilis), közismert nevén a síróbéka, a növényvédőszer-szennyezés bioindikátorfajának bizonyult4,5,6,7,15. A faj Argentína, Uruguay, Paraguay és Brazília állóvizeiben, védett területein vagy változatos élőhelyű területein található1617, és az IUCN osztályozása stabilnak tekinti széles körű elterjedése és a különböző élőhelyekkel szembeni toleranciája miatt18.
Kétéltűeknél a cipermetrinnek való kitettség után szubletális hatásokról számoltak be, beleértve az ebihalak viselkedési, morfológiai és biokémiai változásait23,24,25, megváltozott mortalitást és metamorfózis időt, enzimatikus változásokat, csökkent kelési sikert24,25, hiperaktivitást26, kolinészteráz aktivitás gátlását27 és az úszási teljesítmény változásait7,28. A cipermetrin kétéltűekre gyakorolt genotoxikus hatásairól azonban kevés tanulmány készült. Ezért fontos felmérni az anuránfajok cipermetrinre való érzékenységét.
A környezetszennyezés befolyásolja a kétéltűek normális növekedését és fejlődését, de a legsúlyosabb káros hatás a növényvédőszer-expozíció okozta DNS-génkárosodás13. A vérsejtek morfológiai elemzése fontos bioindikátora a szennyezésnek és egy anyag vadon élő fajokra gyakorolt potenciális toxicitásának29. A mikronukleusz-teszt az egyik leggyakrabban használt módszer a környezetben lévő vegyi anyagok genotoxicitásának meghatározására30. Ez egy gyors, hatékony és olcsó módszer, amely jó indikátora az olyan élőlények kémiai szennyezésének, mint a kétéltűek31,32, és információt nyújthat a genotoxikus szennyező anyagoknak való kitettségről33.
A tanulmány célja a kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmények kis vízi ebihalakra gyakorolt toxikus potenciáljának értékelése volt mikronukleusz teszt és ökológiai kockázatértékelés segítségével.
A teszt akut időszakában különböző koncentrációjú kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrinnek kitett P. gracilis ebihalak kumulatív mortalitása (%).
A krónikus teszt során különböző koncentrációjú kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrinnek kitett P. gracilis ebihalak kumulatív mortalitása (%).
A megfigyelt magas mortalitás a különböző cipermetrin-koncentrációknak (6 és 20 μg/l) kitett kétéltűek genotoxikus hatásainak eredménye volt, amit a mikronukleuszok (MN) és a eritrocitákban található nukleáris rendellenességek bizonyítanak. Az MN kialakulása a mitózis hibáira utal, és összefüggésben áll a kromoszómák mikrotubulusokhoz való gyenge kötődésével, a kromoszómafelvételért és -szállításért felelős fehérjekomplexek hibáival, a kromoszóma-szegregáció hibáival és a DNS-károsodások javításának hibáival38,39, és összefüggésben állhat a növényvédő szerek által kiváltott oxidatív stresszel40,41. Egyéb rendellenességeket is megfigyeltek az összes vizsgált koncentrációnál. A növekvő cipermetrin-koncentrációk 5%-kal, illetve 20%-kal növelték az eritrociták nukleáris rendellenességeit a legalacsonyabb (1 μg/l) és a legmagasabb (20 μg/l) dózisnál. Például egy faj DNS-ében bekövetkező változások súlyos következményekkel járhatnak mind a rövid, mind a hosszú távú túlélésre nézve, ami populációcsökkenést, megváltozott reprodukciós képességet, beltenyészetet, a genetikai sokféleség csökkenését és megváltozott migrációs rátát eredményezhet. Mindezek a tényezők befolyásolhatják a fajok túlélését és fenntartását42,43. Az eritroid rendellenességek kialakulása a citokinézis blokkolására utalhat, ami abnormális sejtosztódást eredményez (kétmagvú eritrociták)44,45; a többlebenyű sejtmagok a sejtmagmembrán több lebennyel rendelkező nyúlványai46, míg más eritroid rendellenességek, például a sejtmagvesék/hólyagok47, DNS-amplifikációval társulhatnak. Az anukleáris eritrociták jelenléte az oxigénszállítás károsodására utalhat, különösen szennyezett vízben48,49. Az apoptózis a sejthalált jelzi50.
Más tanulmányok is kimutatták a cipermetrin genotoxikus hatásait. Kabaña és munkatársai51 kimutatták mikronukleuszok és nukleáris elváltozások, például kétmagvú sejtek és apoptotikus sejtek jelenlétét az Odontophrynus americanus sejtekben, miután 96 órán át magas koncentrációjú cipermetrinnek (5000 és 10 000 μg L−1) voltak kitéve. A cipermetrin által kiváltott apoptózist P. biligonigerus52 és Rhinella arenarum53 baktériumokban is kimutatták. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a cipermetrin genotoxikus hatással van számos vízi élőlényre, és hogy az MN és ENA vizsgálat a kétéltűekre gyakorolt szubletális hatások indikátora lehet, és alkalmazható lehet a toxikus anyagoknak kitett őshonos fajokra és vadon élő populációkra12.
A cipermetrin kereskedelmi forgalomban kapható készítményei magas környezeti kockázatot jelentenek (mind akut, mind krónikus formában), mivel a HQ-értékek meghaladják az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynökségének (EPA) szintjét54, ami károsan befolyásolhatja a fajt, ha jelen van a környezetben. A krónikus kockázatértékelésben a mortalitásra vonatkozó NOEC 3 μg L−1 volt, ami megerősíti, hogy a vízben található koncentrációk kockázatot jelenthetnek a fajra55. Az endoszulfán és cipermetrin keverékének kitett R. arenarum lárvák letális NOEC értéke 500 μg L−1 volt 168 óra elteltével; ez az érték 336 óra elteltével 0,0005 μg L−1-re csökkent. A szerzők kimutatják, hogy minél hosszabb az expozíció, annál alacsonyabbak a fajra káros koncentrációk. Fontos kiemelni azt is, hogy a NOEC-értékek magasabbak voltak, mint a P. gracilis esetében ugyanabban az expozíciós időben, ami azt jelzi, hogy a faj cipermetrinre adott válasza fajspecifikus. Továbbá a mortalitás tekintetében a P. gracilis CHQ-értéke a cipermetrinnek való kitettség után elérte a 64,67-et, ami magasabb, mint az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége által meghatározott referenciaérték54, és az R. arenarum lárvák CHQ-értéke is magasabb volt ennél az értéknél (CHQ > 388,00 336 óra után), ami arra utal, hogy a vizsgált rovarirtó szerek nagy kockázatot jelentenek számos kétéltű fajra. Figyelembe véve, hogy a P. gracilis-nek körülbelül 30 napra van szüksége a teljes metamorfózishoz56, arra lehet következtetni, hogy a vizsgált cipermetrin-koncentrációk hozzájárulhatnak a populáció csökkenéséhez azáltal, hogy megakadályozzák a fertőzött egyedek korai kifejlett vagy reproduktív állapotba lépését.
A mikronukleuszok és más eritrocita magrendellenességek számított kockázatértékelése során a CHQ-értékek 14,92 és 97,00 között mozogtak, ami azt jelzi, hogy a cipermetrin potenciális genotoxikus kockázatot jelent a P. gracilis számára még természetes élőhelyén is. A mortalitást figyelembe véve a P. gracilis által tolerálható xenobiotikus vegyületek maximális koncentrációja 4,24 μg L−1 volt. Azonban már 1 μg/L koncentrációk is genotoxikus hatást mutattak. Ez a tény a rendellenes egyedek számának növekedéséhez vezethet,57 és befolyásolhatja a fajok fejlődését és szaporodását élőhelyeiken, ami a kétéltűek populációinak csökkenéséhez vezethet.
A cipermetrin nevű rovarirtó szer kereskedelmi forgalomban kapható készítményei magas akut és krónikus toxicitást mutattak a P. gracilis ellen. Magasabb halálozási arányt figyeltek meg, valószínűleg a toxikus hatások miatt, amint azt a mikronukleuszok és az eritrocita magvak rendellenességei, különösen a fűrészes magvak, a lebenyes magvak és a vezikuláris magvak jelenléte is bizonyította. Ezenkívül a vizsgált fajok fokozott környezeti kockázatot mutattak, mind akut, mind krónikus szinten. Ezek az adatok, kutatócsoportunk korábbi vizsgálataival kombinálva, azt mutatták, hogy még a cipermetrin különböző kereskedelmi forgalomban kapható készítményei is csökkent acetilkolinészteráz (AChE) és butirilkolinészteráz (BChE) aktivitást és oxidatív stresszt58 okoztak, valamint változásokat az úszási aktivitásban és orális rendellenességeket59 eredményeztek a P. gracilisnél, ami arra utal, hogy a cipermetrin kereskedelmi forgalomban kapható készítményei magas letális és szubletális toxicitást mutatnak erre a fajra. Hartmann és munkatársai60 azt találták, hogy a cipermetrin kereskedelmi forgalomban kapható készítményei voltak a legtoxikusabbak a P. gracilisre és ugyanazon nemzetségbe tartozó egy másik fajra (P. cuvieri) kilenc másik növényvédő szerhez képest. Ez arra utal, hogy a környezetvédelem céljából jogilag jóváhagyott cipermetrin koncentrációk magas halálozási arányt és hosszú távú populációcsökkenést eredményezhetnek.
További vizsgálatokra van szükség a növényvédő szer kétéltűekre gyakorolt toxicitásának felméréséhez, mivel a környezetben található koncentrációk magas halálozási arányt okozhatnak, és potenciális kockázatot jelenthetnek a P. gracilis számára. Ösztönözni kell a kétéltű fajokkal kapcsolatos kutatásokat, mivel ezekről az élőlényekről, különösen a brazil fajokról, kevés adat áll rendelkezésre.
A krónikus toxicitási vizsgálat 168 órán át (7 napig) tartott statikus körülmények között, a szubletális koncentrációk pedig a következők voltak: 1, 3, 6 és 20 μg hatóanyag L−1. Mindkét kísérletben kezelési csoportonként 10 ebihalat értékeltek hat ismétléssel, összesen 60 ebihalat koncentrációnként. Eközben a csak vizet alkalmazó kezelés negatív kontrollként szolgált. Minden kísérleti beállítás egy 500 ml űrtartalmú steril üvegedényből állt, amelynek sűrűsége 1 ebihal/50 ml oldat volt. A lombikot polietilén fóliával fedték le a párolgás megakadályozása érdekében, és folyamatosan levegőztették.
A vizet kémiailag elemezték a peszticidkoncentrációk meghatározása érdekében 0, 96 és 168 óra elteltével. Sabin és munkatársai68, valamint Martins és munkatársai69 szerint az elemzéseket a Santa Maria Szövetségi Egyetem Peszticid Elemző Laboratóriumában (LARP) végezték gázkromatográfiával és tripla kvadrupól tömegspektrometriával összekapcsolt módszerrel (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). A vízben lévő peszticidek mennyiségi meghatározását kiegészítő anyagként mutatjuk be (SM1. táblázat).
A mikronukleusz teszthez (MNT) és a vörösvérsejt-magrendellenesség teszthez (RNS) mindkét kezelési csoportból 15 ebihalat elemeztek. Az ebihalakat 5%-os lidokainnal (50 mg g-170) altatták, és a vérmintákat eldobható heparinos fecskendőkkel szívpunkcióval vették. A vérkeneteket steril mikroszkóp tárgylemezeken készítették, levegőn szárították, 100%-os metanollal (4 °C) fixálták 2 percig, majd 10%-os Giemsa-oldattal festették 15 percig sötétben. A folyamat végén a tárgylemezeket desztillált vízzel mosták a felesleges festék eltávolítása érdekében, majd szobahőmérsékleten szárították.
Minden egyes ebihalból legalább 1000 vörösvérsejtet elemeztek 100×-os mikroszkóppal, 71-es objektívvel, hogy meghatározzák a MN és az ENA jelenlétét. Összesen 75 796 ebihalból származó vörösvérsejtet értékeltek, figyelembe véve a cipermetrin koncentrációkat és a kontrollokat. A genotoxicitást Carrasco és munkatársai, valamint Fenech és munkatársai38,72 módszere szerint elemezték, a következő magkárosodások gyakoriságát meghatározva: (1) anukleáris sejtek: sejtmag nélküli sejtek; (2) apoptotikus sejtek: sejtmagfragmentáció, programozott sejthalál; (3) kétmagvú sejtek: két sejtmaggal rendelkező sejtek; (4) sejtmagrügyek vagy hólyagsejtek: olyan sejtek, amelyek magjában a magmembrán kis kiemelkedései vannak, a hólyagok mérete hasonló a mikronukleuszokéhoz; (5) kariolizált sejtek: olyan sejtek, amelyekben csak a sejtmag körvonala látható belső anyag nélkül; (6) bevágott sejtek: olyan sejtek, amelyek magjában látható repedések vagy bevágások az alakjukban, más néven vese alakú sejtmagok; (7) lebenyes sejtek: a fent említett vezikuláknál nagyobb magnyúlványokkal rendelkező sejtek; és (8) mikrosejtek: kondenzált maggal és redukált citoplazmával rendelkező sejtek. A változásokat összehasonlítottuk a negatív kontroll eredményeivel.
Az akut toxicitási teszt eredményeit (LC50) GBasic szoftverrel és a TSK-Trimmed Spearman-Karber módszerrel elemeztük. A krónikus tesztadatokat előteszteltük a hiba normalitása (Shapiro-Wilks) és a variancia homogenitása (Bartlett) szempontjából. Az eredményeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük. Tukey-tesztet alkalmaztunk az adatok egymás közötti összehasonlítására, Dunnett-tesztet pedig a kezelési csoport és a negatív kontrollcsoport adatainak összehasonlítására.
A LOEC és NOEC adatokat Dunnett-teszttel elemeztük. A statisztikai teszteket Statistica 8.0 szoftverrel (StatSoft) végeztük 95%-os szignifikanciaszinttel (p < 0,05).
Közzététel ideje: 2025. márc. 13.