Ez a tanulmány értékelte a kereskedelmi forgalomban lévő termékek letalitását, szubletalitását és toxicitásátcipermetrinkészítmények anurán ebihalak számára. Az akut tesztben 100-800 μg/l koncentrációt vizsgáltak 96 órán keresztül. A krónikus tesztben a természetben előforduló cipermetrin koncentrációkat (1, 3, 6 és 20 μg/L) vizsgálták a mortalitás szempontjából, ezt követte a mikronukleusz-teszt és a vörösvérsejt-mag-rendellenességek 7 napon keresztül. A kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmény ebihalak LC50 értéke 273,41 μg L-1 volt. A krónikus tesztben a legmagasabb koncentráció (20 μg L−1) több mint 50%-os mortalitást eredményezett, mivel a vizsgált ebihalak felét elpusztította. A mikronukleusz-teszt szignifikáns eredményeket mutatott 6 és 20 μg L-1-nél, és számos sejtmag-rendellenességet észleltek, ami arra utal, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmény genotoxikus potenciállal rendelkezik a P. gracilis ellen. A cipermetrin nagy kockázatot jelent erre a fajra nézve, ami azt jelzi, hogy számos problémát okozhat, és rövid és hosszú távon befolyásolhatja az ökoszisztéma dinamikáját. Ezért arra a következtetésre lehet jutni, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin készítmények toxikus hatást gyakorolnak a P. gracilisre.
A mezőgazdasági tevékenység folyamatos bővülése és intenzív alkalmazása miattkártevőirtásintézkedések, a vízi állatok gyakran vannak kitéve peszticideknek1,2. A mezőgazdasági területek közelében lévő vízkészletek szennyezése befolyásolhatja a nem célszervezetek, például a kétéltűek fejlődését és túlélését.
A kétéltűek egyre fontosabb szerepet töltenek be a környezeti mátrixok értékelésében. Az anuránokat a környezetszennyező anyagok jó bioindikátoraiként tartják számon olyan egyedi tulajdonságaik miatt, mint például összetett életciklusuk, gyors lárvanövekedési sebességük, trofikus állapotuk, áteresztő bőrük10,11, szaporodási szempontból a víztől való függés12 és a nem védett tojások11,13,14. A kis vízibéka (Physalaemus gracilis), közismert nevén síró béka, a növényvédőszer-szennyezés bioindikátor fajának bizonyult4,5,6,7,15. A faj állóvizekben, védett területeken vagy változó élőhelyű területeken található Argentínában, Uruguayban, Paraguayban és Brazíliában1617, és az IUCN besorolása szerint stabilnak tekinthető széles elterjedtsége és a különböző élőhelyekkel szembeni toleranciája miatt18.
Kétéltűeknél szubletális hatásokról számoltak be a cipermetrin expozíciót követően, ideértve az ebihalak viselkedési, morfológiai és biokémiai változásait23, 24, 25, a mortalitás és a metamorfózis idejének megváltozását, az enzimatikus változásokat, a kelési siker csökkenését24, 25, a hiperaktivitást26, a kolinészteráz aktivitás gátlását27 és 8. A cipermetrin kétéltűeken végzett genotoxikus hatásaira vonatkozó vizsgálatok azonban korlátozottak. Ezért fontos felmérni az anurán fajok cipermetrinre való érzékenységét.
A környezetszennyezés befolyásolja a kétéltűek normális növekedését és fejlődését, de a legsúlyosabb káros hatás a DNS-nek a növényvédőszer-expozíció által okozott genetikai károsodása13. A vérsejt-morfológiai elemzés fontos bioindikátora a szennyezésnek és az anyag vadon élő fajokra gyakorolt lehetséges toxicitásának29. A mikronukleusz-teszt az egyik leggyakrabban használt módszer a környezetben lévő vegyi anyagok genotoxicitásának meghatározására30. Ez egy gyors, hatékony és olcsó módszer, amely jól jelzi az olyan szervezetek kémiai szennyezését, mint a kétéltűek31,32, és információt szolgáltathat a genotoxikus szennyező anyagoknak való kitettségről33.
Ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy értékelje a kereskedelmi forgalomban lévő cipermetrin készítmények kisméretű vízi ebihalakra gyakorolt toxikus potenciálját mikronukleusz-teszt és ökológiai kockázatértékelés segítségével.
A kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin különböző koncentrációinak kitett P. gracilis ebihalak kumulatív mortalitása (%) a vizsgálat akut időszaka alatt.
A kereskedelmi forgalomban kapható cipermetrin különböző koncentrációinak kitett P. gracilis ebihalak kumulatív mortalitása (%) krónikus teszt során.
A megfigyelt magas mortalitás a különböző koncentrációjú cipermetrin (6 és 20 μg/L) hatásának kitett kétéltűekben a genotoxikus hatások eredménye, amit a mikronukleusok (MN) jelenléte és az eritrociták sejtmag-rendellenességei bizonyítanak. Az MN képződése a mitózis hibáira utal, és a kromoszómák gyenge kötődésével jár a mikrotubulusokhoz, a kromoszómafelvételért és -szállításért felelős fehérjekomplexek hibáihoz, a kromoszóma szegregáció hibáihoz és a DNS-károsodás helyreállításának hibáihoz38, 39, és összefüggésbe hozható a peszticidek által kiváltott oxidatív stresszel40, 41. Minden értékelt koncentrációnál egyéb rendellenességeket figyeltek meg. A cipermetrin koncentrációjának növekedése 5%-kal, illetve 20%-kal növelte a vörösvértestek magrendellenességét a legalacsonyabb (1 μg/L), illetve a legmagasabb (20 μg/L) dózisnál. Például egy faj DNS-ében bekövetkezett változások súlyos következményekkel járhatnak mind a rövid, mind a hosszú távú túlélésre nézve, ami a populáció csökkenését, a szaporodási alkalmasság megváltozását, a beltenyésztést, a genetikai sokféleség elvesztését és a migrációs ráták megváltozását eredményezheti. Mindezek a tényezők befolyásolhatják a fajok túlélését és fenntartását42,43. Az eritroid rendellenességek kialakulása a citokinézis blokkolására utalhat, ami rendellenes sejtosztódást eredményez (kétmagvú eritrociták)44,45; A többlebenyű magok a nukleáris membrán több lebenyű kiemelkedései46, míg más eritroid-rendellenességek összefüggésbe hozhatók a DNS-amplifikációval, például a magvesék/hólyagok47. Az anucleated eritrociták jelenléte az oxigéntranszport károsodására utalhat, különösen szennyezett vízben48,49. Az apoptózis sejthalált jelez50.
Más vizsgálatok is kimutatták a cipermetrin genotoxikus hatásait. Kabaña és munkatársai51 kimutatták mikronukleusok és nukleáris változások, például kétmagvú sejtek és apoptotikus sejtek jelenlétét Odontophrynus americanus sejtekben, miután 96 órán keresztül magas koncentrációjú cipermetrinnek (5000 és 10 000 μg L-1) voltak kitéve. A cipermetrin által kiváltott apoptózist P. biligonigerus52-ben és Rhinella arenarum53-ban is kimutatták. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a cipermetrin genotoxikus hatást fejt ki számos vízi organizmusra, és hogy az MN- és ENA-teszt a kétéltűekre gyakorolt szubletális hatások indikátora lehet, és alkalmazható lehet a toxikus anyagoknak kitett őshonos fajokra és vadon élő populációkra12.
A cipermetrin kereskedelmi forgalomban kapható készítményei nagy környezeti veszélyt jelentenek (akut és krónikus egyaránt), a központok meghaladják az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége (EPA) szintjét54, ami káros hatással lehet a fajra, ha jelen van a környezetben. A krónikus kockázatértékelésben a mortalitás NOEC értéke 3 μg L−1 volt, ami megerősíti, hogy a vízben talált koncentrációk kockázatot jelenthetnek a fajra55. Az endoszulfán és cipermetrin keverékének kitett R. arenarum lárvák halálos NOEC értéke 500 μg L−1 volt 168 óra elteltével; ez az érték 0,0005 μg L−1-re csökkent 336 óra elteltével. A szerzők azt mutatják, hogy minél hosszabb az expozíció, annál alacsonyabbak a fajra káros koncentrációk. Fontos kiemelni azt is, hogy a NOEC értékek magasabbak voltak, mint a P. gracilis értékei azonos expozíciós idő mellett, ami azt jelzi, hogy a cipermetrinre adott fajválasz fajspecifikus. Továbbá a mortalitás tekintetében a P. gracilis CHQ értéke a cipermetrin expozíció után elérte a 64,67-et, ami magasabb, mint az Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynöksége által meghatározott referenciaérték54, és a R. arenarum lárvák CHQ értéke is magasabb volt ennél az értéknél (CHQ > 388,00 336 óra elteltével), ami arra utal, hogy több vizsgált faj esetében magas az ecticidák kockázata. Figyelembe véve, hogy a P. gracilisnek körülbelül 30 napra van szüksége a metamorfózis befejezéséhez56, arra a következtetésre juthatunk, hogy a cipermetrin vizsgált koncentrációi hozzájárulhatnak a populáció csökkenéséhez azáltal, hogy megakadályozzák, hogy a fertőzött egyedek korán felnőtt vagy szaporodási szakaszba kerüljenek.
A mikronukleuszok és más eritrocita-magrendellenességek számított kockázatértékelése során a CHQ értékek 14,92 és 97,00 között mozogtak, ami azt jelzi, hogy a cipermetrin potenciális genotoxikus kockázatot jelenthet a P. gracilis számára még természetes élőhelyén is. A mortalitást figyelembe véve a P. gracilis számára tolerálható xenobiotikus vegyületek maximális koncentrációja 4,24 μg L−1 volt. Mindazonáltal már 1 μg/l koncentrációk is genotoxikus hatást mutattak. Ez a tény a kóros egyedek számának növekedéséhez57 vezethet, és hatással lehet a fajok fejlődésére és szaporodására élőhelyeiken, ami a kétéltű populációk csökkenéséhez vezethet.
A cipermetrin inszekticid kereskedelmi készítményei nagy akut és krónikus toxicitást mutattak a P. gracilis számára. Magasabb mortalitási arányt figyeltek meg, valószínűleg toxikus hatások miatt, amit a mikronukleuszok és az eritrocita magrendellenességek jelenléte bizonyít, különösen a fogazott magok, a karéjos magok és a hólyagos magok. Ezenkívül a vizsgált fajok fokozott környezeti kockázatot mutattak, mind akut, mind krónikus formában. Ezek az adatok a kutatócsoportunk korábbi tanulmányaival kombinálva azt mutatták, hogy még a cipermetrin különböző kereskedelmi formái is csökkentették az acetilkolinészteráz (AChE) és butirilkolinészteráz (BChE) aktivitását és az oxidatív stresszt58, valamint az úszásaktivitás változását és a szájüregi fejlődési rendellenességeket59 eredményezték P. gracilisben, ami azt jelzi, hogy ennek a kereskedelmi forgalomban lévő készítménynek a lehalálozása magas. Hartmann és mtsai. 60 azt találta, hogy a cipermetrin kereskedelmi forgalomban kapható készítményei a legmérgezőbbek a P. gracilisre és az azonos nemzetséghez tartozó egy másik fajra (P. cuvieri) összehasonlítva kilenc másik peszticiddel. Ez arra utal, hogy a cipermetrin környezetvédelmi célú, törvényesen jóváhagyott koncentrációja magas halálozási arányt és hosszú távú népességcsökkenést eredményezhet.
További vizsgálatokra van szükség a peszticid kétéltűekre gyakorolt toxicitásának felmérésére, mivel a környezetben található koncentrációk magas mortalitást okozhatnak, és potenciális kockázatot jelenthetnek a P. gracilis számára. Ösztönözni kell a kétéltű fajokkal kapcsolatos kutatást, mivel ezekről az élőlényekről kevés adat áll rendelkezésre, különösen a brazil fajokról.
A krónikus toxicitási teszt 168 órán át (7 napig) tartott statikus körülmények között, és a szubletális koncentrációk a következők voltak: 1, 3, 6 és 20 μg ai L−1. Mindkét kísérletben kezelt csoportonként 10 ebihalat értékeltünk hat ismétléssel, koncentrációnként összesen 60 ebihalat. Eközben a csak vízzel végzett kezelés negatív kontrollként szolgált. Mindegyik kísérleti összeállítás 500 ml-es, 1 ebihal/50 ml oldat sűrűségű steril üvegcsészéből állt. A lombikot polietilén fóliával borították, hogy megakadályozzák a párolgást, és folyamatosan levegőztetjük.
A vizet kémiailag elemeztük, hogy meghatározzuk a peszticid koncentrációt 0, 96 és 168 óránál. Sabin et al. 68 és Martins et al. 69. ábra szerint az elemzéseket a Santa Maria Szövetségi Egyetem Peszticidelemző Laboratóriumában (LARP) végezték, háromszoros kvadrupólusos tömegspektrometriához kapcsolt gázkromatográfiával (Varian model 1200, Palo Alto, California, USA). A vízben található növényvédő szerek mennyiségi meghatározását kiegészítő anyagként mutatjuk be (SM1. táblázat).
A mikronukleusz-teszthez (MNT) és a vörösvérsejt-nukleáris abnormalitási teszthez (RNS) minden egyes kezelési csoportból 15 ebihalat elemeztünk. Az ebihalakat 5%-os lidokainnal (50 mg g-170) érzéstelenítettük, és szívpunkcióval vérmintákat vettünk eldobható heparinizált fecskendővel. Steril mikroszkóp tárgylemezeken vérkeneteket készítettünk, levegőn szárítottuk, 100%-os metanollal (4 °C) fixáltuk 2 percig, majd 10%-os Giemsa oldattal festettük 15 percig sötétben. Az eljárás végén a lemezeket desztillált vízzel mostuk a felesleges folt eltávolítása érdekében, és szobahőmérsékleten szárítottuk.
Minden ebihalból legalább 1000 vörösvértestet elemeztünk 100×-os mikroszkóppal 71 objektívvel, hogy meghatározzuk az MN és az ENA jelenlétét. Az ebihalakból származó összesen 75 796 vörösvértestet értékeltek ki a cipermetrin koncentrációk és a kontrollok figyelembevételével. A genotoxicitást Carrasco et al. és Fenech és mtsai.38,72 a következő magsérülések gyakoriságának meghatározásával: (1) magsejtek: sejtmag nélküli sejtek; (2) apoptotikus sejtek: nukleáris fragmentáció, programozott sejthalál; (3) kétmagvú sejtek: két maggal rendelkező sejtek; (4) nukleáris bimbók vagy foltos sejtek: olyan sejtek, amelyek magjai kis kiemelkedésekkel rendelkeznek a nukleáris membránon, és a mikronukleuszokhoz hasonló méretű hólyagok; (5) kariolizált sejtek: olyan sejtek, amelyek csak a sejtmag körvonalával rendelkeznek, belső anyag nélkül; (6) rovátkolt sejtek: olyan sejtmagok, amelyek alakjában nyilvánvaló repedések vagy bevágások láthatók, amelyeket vese alakú magoknak is neveznek; (7) lebenyes sejtek: a fent említett vezikuláknál nagyobb magnyúlványokkal rendelkező sejtek; és (8) mikrosejtek: kondenzált sejtmaggal és csökkent citoplazmával rendelkező sejtek. A változásokat összehasonlítottuk a negatív kontrolleredményekkel.
Az akut toxicitási teszt eredményeit (LC50) GBasic szoftverrel és a TSK-Trimmed Spearman-Karber módszerrel74 elemeztük. A krónikus tesztadatokat előzetesen teszteltük a hibanormalitás (Shapiro-Wilks) és a varianciahomogenitás (Bartlett) szempontjából. Az eredményeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük. Tukey tesztet használták az adatok egymás közötti összehasonlítására, Dunnett tesztet pedig a kezelt csoport és a negatív kontrollcsoport közötti adatok összehasonlítására.
A LOEC és NOEC adatokat Dunnett teszttel elemeztük. A statisztikai teszteket Statistica 8.0 szoftverrel (StatSoft) végeztük 95%-os szignifikanciaszinttel (p < 0,05).
Feladás időpontja: 2025. március 13