A DELLA fehérjék konzerváltaknövekedésszabályozókamelyek központi szerepet játszanak a növények fejlődésében, belső és külső jelekre adott válaszként. Transzkripciós szabályozóként a DELLA-k GRAS doménjeiken keresztül kötődnek transzkripciós faktorokhoz (TF) és a H2A hisztonhoz, és promóterekre hatnak. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a DELLA stabilitását poszttranszlációsan két mechanizmus szabályozza: a növényi hormon által indukált poliubiquitinációgibberellin, ami gyors lebomlásához, valamint kis ubiquitinszerű módosítóval (SUMO) való konjugációhoz vezet, ami növeli felhalmozódásukat. Ezenkívül a DELLA aktivitását két különböző glikozilációs mechanizmus szabályozza dinamikusan: az O-fukozilezés fokozza a DELLA-TF kölcsönhatást, míg az O-kapcsolt N-acetilglükózamin (O-GlcNAc) módosítás gátolja a DELLA-TF kölcsönhatást. A DELLA foszforilációjának szerepe azonban nem világos, mivel a korábbi tanulmányok ellentmondásos eredményeket mutattak, egyesek szerint a foszforiláció elősegíti vagy gátolja a DELLA lebomlását, mások szerint a foszforiláció nem befolyásolja stabilitásukat. Jelen tanulmányban azonosítjuk a GA1-3 represszor (RGA), az Arabidopsis thaliana-ból tömegspektrometriával tisztított AtDELLA foszforilációs helyeit, és kimutatjuk, hogy két RGA peptid foszforilációja a PolyS és PolyS/T régiókban fokozza az RGA aktivitást azáltal, hogy elősegíti a H2A kötődést és az RGA asszociációját a célpromóterekkel. Figyelemre méltó, hogy a foszforiláció nem befolyásolta az RGA-TF kölcsönhatásokat vagy az RGA stabilitását. Tanulmányunk egy molekuláris mechanizmust tár fel, amellyel a foszforiláció DELLA aktivitást indukál.
Tömegspektrometriás elemzésünk kimutatta, hogy mind a Pep1, mind a Pep2 nagymértékben foszforilált volt az RGA-ban a GA-hiányos Ga1 háttérben. Ezen tanulmány mellett foszfoproteomikai vizsgálatok is kimutatták a Pep1 foszforilációját az RGA-ban, bár szerepét még nem vizsgálták53,54,55. Ezzel szemben a Pep2 foszforilációját korábban nem írták le, mivel ezt a peptidet csak az RGAGKG transzgén segítségével lehetett kimutatni. Bár az m1A mutáció, amely megszüntette a Pep1 foszforilációját, csak kis mértékben csökkentette az RGA aktivitását a plantában, additív hatással volt az RGA aktivitásának csökkentésére, amikor m2A-val kombinálták (6. kiegészítő ábra). Fontos, hogy a Pep1 foszforilációja szignifikánsan csökkent a GA-val fokozott sly1 mutánsban a ga1-hez képest, ami arra utal, hogy a GA elősegíti az RGA defoszforilációját, csökkentve annak aktivitását. A GA RGA foszforilációjának elnyomására szolgáló mechanizmus további vizsgálatokat igényel. Az egyik lehetőség az, hogy ezt egy azonosítatlan protein-kináz szabályozása révén érik el. Bár tanulmányok kimutatták, hogy a CK1 protein kináz EL1 expresszióját a GA csökkenti a rizsben41, eredményeink azt mutatják, hogy az Arabidopsis EL1 homológ magasabb rendű mutációi (AEL1-4) nem csökkentik az RGA foszforilációját. Eredményeinkkel összhangban egy nemrégiben végzett, Arabidopsis AEL túltermelő vonalakkal és egy ael tripla mutánssal végzett foszfoproteomikai vizsgálat nem azonosított DELLA fehérjéket ezen kinázok szubsztrátjaként56. A kézirat elkészítésekor arról számoltak be, hogy a GSK3, a búzában (Triticum aestivum) GSK3/SHAGGY-szerű kinázt kódoló gén, képes foszforilálni a DELLA-t (Rht-B1b)57, bár az Rht-B1b GSK3 általi foszforilációját in planta nem igazolták. Az in vitro enzimatikus reakciók GSK3 jelenlétében, majd tömegspektrometriás analízissel három foszforilációs helyet mutattak ki az Rht-B1b DELLA és GRAS doménjei között (3. kiegészítő ábra). A szerin-alanin szubsztitúciók mindhárom foszforilációs helyen csökkent Rht-B1b aktivitást eredményeztek transzgénikus búzában, összhangban azzal az eredményünkkel, hogy a Pep2 RGA-ban bekövetkező alanin szubsztitúciók csökkentették az RGA aktivitását. Az in vitro fehérjebontási vizsgálatok azonban tovább igazolták, hogy a foszforiláció az Rht-B1b57-et is stabilizálhatja. Ez ellentétben áll az eredményeinkkel, amelyek azt mutatják, hogy a Pep2 RGA-ban bekövetkező alanin szubsztitúciók nem változtatják meg a stabilitását in planta. A búzában található GSK3 a brasszinoszteroid-inszenzitív 2-es fehérje (BIN2) ortológja az Arabidopsisban 57. A BIN2 a BR jelátvitel negatív szabályozója, és a BR a BIN2 lebontásának okozásával aktiválja jelátviteli útvonalát 58. Megmutattuk, hogy a BR-kezelés nem csökkenti az RGA stabilitását 59 vagy a foszforilációs szinteket Arabidopsisban (2. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy az RGA valószínűleg nem foszforilálódik a BIN2 által.
Minden kvantitatív adatot statisztikailag Excel segítségével elemeztünk, és a szignifikáns különbségeket Student-féle t-próbával határoztuk meg. A minta méretének előzetes meghatározásához nem alkalmaztunk statisztikai módszereket. Az elemzésből nem zártunk ki adatokat; a kísérlet nem volt randomizált; és a kutatók tisztában voltak az elosztással a kísérlet és az eredményértékelés során. A minta méretét az ábrák jelmagyarázatai és a nyers adatfájlok tartalmazzák.
Közzététel ideje: 2025. április 15.