A DELLA fehérjék konzerváltaknövekedésszabályozókamelyek központi szerepet játszanak a növények fejlődésében a belső és külső jelekre reagálva. Transzkripciós szabályozóként a DELLA-k a transzkripciós faktorokhoz (TF-ekhez) és a H2A-hisztonhoz kötődnek GRAS doménjeiken keresztül, és a promóterekre hatnak. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a DELLA stabilitását poszttranszlációsan két mechanizmus szabályozza: a növényi hormon által kiváltott poliubiquitinációgibberellin, ami gyors lebomlásukhoz és kis ubiquitin-szerű módosítóval (SUMO) való konjugációhoz vezet, ami növeli felhalmozódásukat. Ezenkívül a DELLA aktivitását két különböző glikozilációs mechanizmus dinamikusan szabályozza: az O-fukoziláció fokozza a DELLA-TF kölcsönhatást, míg az O-kapcsolt N-acetil-glükózamin (O-GlcNAc) módosítása gátolja a DELLA-TF kölcsönhatást. A DELLA foszforilációjának szerepe azonban nem világos, mivel a korábbi vizsgálatok ellentmondó eredményeket mutattak, egyesek azt sugallják, hogy a foszforiláció elősegíti vagy elnyomja a DELLA lebomlását, mások pedig azt, hogy a foszforiláció nem befolyásolja a stabilitásukat. Itt azonosítjuk a foszforilációs helyeket a GA1-3 represszorban (RGA), az Arabidopsis thaliana-ból tömegspektrometriával tisztított AtDELLA-ban, és megmutatjuk, hogy két RGA peptid foszforilációja a PolyS és PolyS/T régiókban fokozza az RGA aktivitást azáltal, hogy elősegíti a H2A kötődést és az RGA asszociációt a célpromoterekkel. Nevezetesen, a foszforiláció nem befolyásolta az RGA-TF kölcsönhatásokat vagy az RGA stabilitását. Vizsgálatunk egy olyan molekuláris mechanizmust tár fel, amellyel a foszforiláció indukálja a DELLA aktivitását.
Tömegspektrometriás elemzésünk kimutatta, hogy mind a Pep1, mind a Pep2 erősen foszforilált RGA-ban a GA-hiányos Ga1 háttérben. Ezen a tanulmányon kívül a foszfoproteomikai vizsgálatok a Pep1 foszforilációját is feltárták az RGA-ban, bár szerepét még nem vizsgálták53,54,55. Ezzel szemben a Pep2 foszforilációját korábban nem írták le, mivel ezt a peptidet csak az RGAGKG transzgén segítségével lehetett kimutatni. Bár az m1A mutáció, amely megszüntette a Pep1 foszforilációját, csak kis mértékben csökkentette az RGA aktivitást a növényben, additív hatást fejtett ki az m2A-val kombinálva az RGA aktivitás csökkentésében (6. kiegészítő ábra). Fontos, hogy a Pep1 foszforilációja szignifikánsan csökkent a GA-val fokozott sly1 mutánsban a ga1-hez képest, ami arra utal, hogy a GA elősegíti az RGA defoszforilációját, csökkentve annak aktivitását. Az a mechanizmus, amellyel a GA elnyomja az RGA-foszforilációt, további vizsgálatokat igényel. Az egyik lehetőség az, hogy ezt egy azonosítatlan protein-kináz szabályozásával érik el. Bár a vizsgálatok kimutatták, hogy a CK1 fehérjekináz EL1 expresszióját a GA csökkenti a rizsben41, eredményeink azt mutatják, hogy az Arabidopsis EL1 homológ (AEL1-4) magasabb rendű mutációi nem csökkentik az RGA foszforilációját. Eredményeinkkel összhangban egy nemrégiben végzett foszfoproteomikai vizsgálat, amelyben Arabidopsis AEL-túlexpresszáló vonalakat és egy ael tripla mutánst alkalmaztak, nem azonosított egyetlen DELLA fehérjét sem ezeknek a kinázoknak szubsztrátjaként56. A kézirat elkészítésekor arról számoltak be, hogy a GSK3, a GSK3/SHAGGY-szerű kinázt kódoló gén búzában (Triticum aestivum) képes foszforilálni a DELLA (Rht-B1b)57-et, bár az Rht-B1b GSK3 általi foszforilációját növényben nem erősítették meg. A GSK3 jelenlétében végzett in vitro enzimatikus reakciók, majd tömegspektrometriás analízis három foszforilációs helyet tárt fel az Rht-B1b DELLA és GRAS doménje között (kiegészítő 3. ábra). A szerin-alanin szubsztitúciók mindhárom foszforilációs helyen csökkent Rht-B1b aktivitást eredményeztek transzgénikus búzában, összhangban azzal a megállapításunkkal, hogy a Pep2 RGA alanin szubsztitúciói csökkentik az RGA aktivitást. Az in vitro fehérjedegradációs vizsgálatok azonban azt is kimutatták, hogy a foszforiláció is stabilizálja az Rht-B1b57-et. Ez ellentétben áll azokkal az eredményeinkkel, amelyek azt mutatják, hogy a Pep2 RGA-ban az alanin szubsztitúciók nem változtatják meg a növény stabilitását. A búzában található GSK3 a brassinoszteroid-érzéketlen protein 2 (BIN2) ortológja az Arabidopsis 57-ben. A BIN2 a BR jelátvitel negatív szabályozója, a BR pedig a BIN2 lebomlását okozva aktiválja a jelátviteli útvonalát 58. Megmutattuk, hogy a BR kezelés nem csökkenti az RGA stabilitását Ez arra utal, hogy az RGA-t valószínűleg nem foszforilálja a BIN2.
Valamennyi mennyiségi adatot statisztikailag elemeztük Excel segítségével, a szignifikáns különbségeket Student-féle t-próbával határoztuk meg. Nem használtak statisztikai módszereket a minta méretének előre meghatározására. Nem zártak ki adatokat az elemzésből; a kísérletet nem randomizálták; és a kutatók tisztában voltak az elosztással a kísérlet és az eredményértékelés során. A mintaméreteket az ábra jelmagyarázatai és a nyers adatfájlok tartalmazzák.
Feladás időpontja: 2025.04.15