A hajtás apikális merisztémájának (SAM) növekedése kritikus fontosságú a szár felépítése szempontjából.gibberellinekA (GA-k) kulcsszerepet játszanak a növények növekedésének koordinálásában, de a SAM-ban betöltött szerepük még mindig kevéssé ismert. Jelen munkánkban egy ratiometrikus bioszenzort fejlesztettünk ki a GA-jelátvitel mérésére a DELLA fehérje módosításával, amely elnyomja alapvető szabályozó funkcióját a GA transzkripciós válaszban, miközben megőrzi lebomlását a GA felismerése után. Bemutatjuk, hogy ez a lebomláson alapuló bioszenzor pontosan rögzíti a GA-szintek és a sejtek érzékelésének változásait a fejlődés során. Ezt a bioszenzort használtuk a GA-jelátviteli aktivitás feltérképezésére a SAM-ban. Bemutatjuk, hogy a magas GA-jelátviteli jelek elsősorban a szerv primordiumok között elhelyezkedő sejtekben vannak jelen, amelyek az internódiumsejtek prekurzorai. Funkciónyereség- és funkcióvesztéses megközelítések segítségével tovább demonstráljuk, hogy a GA szabályozza a sejtosztódási sík orientációját, létrehozva az internódiumok kanonikus sejtes szerveződését, ezáltal elősegítve az internódium specifikációját a SAM-ban.
A hajtáscsúcson található hajtáscsúcs-merisztéma (SAM) őssejtekből álló résszel rendelkezik, amelyek aktivitása moduláris és iteratív módon generálja az oldalszerveket és a szárcsomókat a növény egész élete során. Ezen ismétlődő egységek, vagy növényi csomópontok mindegyike internódiumokat és oldalszerveket tartalmaz a csomópontokban, valamint hónaljmerisztémákat a levélhónaljakban1. A növényi csomópontok növekedése és szerveződése a fejlődés során változik. Az Arabidopsis esetében az internódium növekedése a vegetatív szakaszban elnyomódik, és a hónaljmerisztémák szunnyadnak a rozettalevelek hónaljában. A virágzási fázisba való átmenet során a SAM virágzati merisztémává válik, megnyúlt internódiumokat és hónaljrügyeket, ágakat a szárlevelek hónaljában, később pedig levéltelen virágokat hoz létre2. Bár jelentős előrelépést tettünk a levelek, virágok és ágak kialakulását szabályozó mechanizmusok megértésében, viszonylag keveset tudunk arról, hogyan keletkeznek az internódiumok.
A GA-k térbeli és időbeli eloszlásának megértése segít jobban megérteni ezen hormonok funkcióit a különböző szövetekben és a különböző fejlődési szakaszokban. Az RGA-GFP fúzió saját promóterének hatására expresszált degradációjának vizualizációja fontos információkat nyújt a teljes GA-szint szabályozásáról a gyökerekben15,16. Az RGA expressziója azonban szövetenként változik17, és a GA18 szabályozza. Így az RGA promóter eltérő expressziója eredményezheti az RGA-GFP-vel megfigyelt fluoreszcencia mintázatot, így ez a módszer nem kvantitatív. Újabban a bioaktív fluoreszceinnel (Fl) jelölt GA19,20 feltárta a GA felhalmozódását a gyökér endokortexében, és sejtszintjének GA-transzport általi szabályozását. Nemrégiben a GA FRET szenzor (nlsGPS1) kimutatta, hogy a GA-szintek korrelálnak a sejtek megnyúlásával a gyökerekben, a filamentumokban és a sötétben növő hipokotilokban21. Azonban, mint láttuk, a GA-koncentráció nem az egyetlen paraméter, amely a GA jelátviteli aktivitását szabályozza, mivel komplex érzékelési folyamatoktól függ. A DELLA és GA jelátviteli útvonalak ismeretére építve, itt egy degradáción alapuló, ratiometrikus bioszenzor fejlesztéséről és jellemzéséről számolunk be, amely a GA jelátvitelét hivatott elősegíteni. Ennek a kvantitatív bioszenzornak a kifejlesztéséhez egy fluoreszcens fehérjéhez fuzionált és a szövetekben mindenütt expresszált mutáns GA-érzékeny RGA-t, valamint egy GA-inszenzitív fluoreszcens fehérjét használtunk. Bemutatjuk, hogy a mutáns RGA fehérjefúziók nem zavarják az endogén GA jelátvitelt, amikor mindenütt expresszálódnak, és hogy ez a bioszenzor nagy térbeli-időbeli felbontással képes számszerűsíteni a GA bemenetből és az érzékelő készülék általi GA jelfeldolgozásból eredő jelátviteli aktivitást. Ezt a bioszenzort használtuk a GA jelátviteli aktivitás térbeli-időbeli eloszlásának feltérképezésére, és annak számszerűsítésére, hogy a GA hogyan szabályozza a sejtek viselkedését a SAM epidermiszben. Bemutatjuk, hogy a GA szabályozza a szervkezdemények között elhelyezkedő SAM sejtek osztódási síkjának orientációját, ezáltal meghatározva az internodum kanonikus sejtes szerveződését.
Végül megvizsgáltuk, hogy a qmRGA képes-e kimutatni az endogén GA-szintek változásait növekvő hipokotilok esetén. Korábban kimutattuk, hogy a nitrát a GA-szintézis fokozásával, és ezáltal a DELLA34 lebontásával serkenti a növekedést. Ennek megfelelően megfigyeltük, hogy a bőséges nitrátellátás (10 mM NO3−) mellett nevelt pUBQ10::qmRGA palánták hipokotiljának hossza szignifikánsan hosszabb volt, mint a nitráthiányos körülmények között nevelt palántáké (6a. kiegészítő ábra). A növekedési válasszal összhangban a GA-jelek magasabbak voltak a 10 mM NO3− körülmények között nevelt palánták hipokotiljaiban, mint a nitrát hiányában nevelt palántákban (6b., c. kiegészítő ábra). Így a qmRGA lehetővé teszi a GA-jelátvitelben bekövetkező változások monitorozását is, amelyeket a GA-koncentráció endogén változásai indukálnak.
Annak megértése érdekében, hogy a qmRGA által detektált GA-jelátviteli aktivitás függ-e a GA-koncentrációtól és a GA-észleléstől, ahogy az a szenzortervezés alapján várható volt, elemeztük a három GID1 receptor expresszióját vegetatív és reproduktív szövetekben. A palántákban a GID1-GUS riportervonal kimutatta, hogy a GID1a és c magas expressziót mutatott a sziklevelekben (3a–c. ábra). Ezenkívül mindhárom receptor expressziója megtalálható volt a levelekben, az oldalgyökér-kezdeményeknél, a gyökércsúcsokban (a GID1b gyökérkalapja kivételével) és az érrendszerben (3a–c. ábra). A virágzatú SAM-ban csak a GID1b és 1c esetében detektáltunk GUS-jeleket (7a–c. kiegészítő ábra). Az in situ hibridizáció megerősítette ezeket az expressziós mintázatokat, és tovább igazolta, hogy a GID1c egyenletesen, alacsony szinten expresszálódott a SAM-ban, míg a GID1b magasabb expressziót mutatott a SAM perifériáján (7d–l. kiegészítő ábra). A pGID1b::2xmTQ2-GID1b transzlációs fúzió a GID1b expressziójának fokozatos tartományát is feltárta, az alacsony vagy nulla expressziótól a SAM közepén a magas expresszióig a szervhatárokon (7m. kiegészítő ábra). Így a GID1 receptorok nem egyenletesen oszlanak el a szövetek között és azokon belül. Későbbi kísérletekben azt is megfigyeltük, hogy a GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) túltermelése növelte a qmRGA érzékenységét a hipokotilokban a külső GA-alkalmazással szemben (3d. és e. ábra). Ezzel szemben a qd17mRGA által a hipokotilban mért fluoreszcencia érzéketlen volt a GA3-kezelésre (3f. és g. ábra). Mindkét vizsgálatban a palántákat magas GA-koncentrációval (100 μM GA3) kezeltük, hogy felmérjük az érzékelő gyors viselkedését, ahol a GID1 receptorhoz való kötődési képesség fokozódott vagy elveszett. Ezek az eredmények együttesen megerősítik, hogy a qmRGA bioszenzor kombinált funkciót tölt be GA és GA érzékelőként, és arra utalnak, hogy a GID1 receptor differenciális expressziója jelentősen befolyásolhatja az érzékelő emissziós tényezőjét.
A GA-jelek eloszlása a SAM-ban a mai napig nem tisztázott. Ezért qmRGA-t expresszáló növényeket és a pCLV3::mCherry-NLS őssejt-riportert35 használtunk a GA-jelátviteli aktivitás nagy felbontású kvantitatív térképeinek kiszámításához, az L1 rétegre (epidermisz; 4a., b. ábra, lásd Módszerek és Kiegészítő módszerek) összpontosítva, mivel az L1 kulcsszerepet játszik a SAM növekedésének szabályozásában36. Itt a pCLV3::mCherry-NLS expresszió fix geometriai referenciapontot biztosított a GA-jelátviteli aktivitás térbeli és időbeli eloszlásának elemzéséhez37. Bár a GA-t elengedhetetlennek tekintik az oldalsó szervek fejlődéséhez4, azt figyeltük meg, hogy a GA-jelek szintje alacsony volt a virágzati primordiumban (P) a P3 stádiumtól kezdve (4a., b. ábra), míg a fiatal P1 és P2 primordiumok mérsékelt aktivitást mutattak, hasonlóan a központi régióban megfigyelhetőhöz (4a., b. ábra). Magasabb GA jelátviteli aktivitást észleltünk a szerv primordium határain, a P1/P2-től (a határ oldalain) kezdve és a P4-nél tetőzve, valamint a primordiumok között elhelyezkedő perifériás régió összes sejtjében (4a., b. ábra és 8a., b. kiegészítő ábra). Ez a magasabb GA jelátviteli aktivitás nemcsak az epidermiszben, hanem az L2 és a felső L3 rétegekben is megfigyelhető volt (8b. kiegészítő ábra). A qmRGA segítségével a SAM-ban detektált GA jelek mintázata az idő múlásával szintén változatlan maradt (8c–f., k. kiegészítő ábra). Bár a qd17mRGA konstrukció szisztematikusan csökkent az öt független vonalból származó T3 növények SAM-jában, amelyeket részletesen jellemeztünk, elemezni tudtuk a pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstrukcióval kapott fluoreszcencia mintázatokat (8g–j., l. kiegészítő ábra). Ebben a kontrollvonalban csak kisebb változásokat észleltünk a fluoreszcencia arányban a SAM-ban, de a SAM középpontjában a TagBFP-vel összefüggő VENUS egyértelmű és váratlan csökkenését figyeltük meg. Ez megerősíti, hogy a qmRGA által megfigyelt jelátviteli minta az mRGA-VENUS GA-függő degradációját tükrözi, de azt is bizonyítja, hogy a qmRGA túlbecsülheti a GA jelátviteli aktivitást a merisztémaközpontban. Összefoglalva, eredményeink egy olyan GA jelátviteli mintázatot mutatnak, amely elsősorban a primordiumok eloszlását tükrözi. Az interprimordiális régió (IPR) ezen eloszlása a fejlődő primordium és a központi régió közötti magas GA jelátviteli aktivitás fokozatos kialakulásának köszönhető, miközben a GA jelátviteli aktivitás a primordiumban csökken (4c., d. ábra).
A GID1b és GID1c receptorok eloszlása (lásd fent) arra utal, hogy a GA receptorok eltérő expressziója segít formálni a GA jelátviteli aktivitás mintázatát a SAM-ban. Arra voltunk kíváncsiak, hogy vajon szerepet játszhat-e a GA eltérő felhalmozódása. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára az nlsGPS1 GA FRET szenzort21 használtuk. A 10 μM GA4+7-tel 100 percig kezelt nlsGPS1 SAM-jában megnövekedett aktivációs gyakoriságot észleltünk (9a–e. kiegészítő ábra), ami azt jelzi, hogy az nlsGPS1 ugyanúgy reagál a GA-koncentráció változásaira a SAM-ban, mint a gyökerekben21. Az nlsGPS1 aktivációs gyakoriságának térbeli eloszlása viszonylag alacsony GA-szinteket mutatott a SAM külső rétegeiben, de azt mutatta, hogy ezek emelkedtek a SAM közepén és határain (4e. ábra és 9a, c. kiegészítő ábra). Ez arra utal, hogy a GA szintén a SAM-ban oszlik el, a qmRGA által feltárt térbeli mintázattal. Kiegészítő megközelítésként a SAM-ot fluoreszcens GA-val (GA3-, GA4-, GA7-Fl) vagy negatív kontrollként csak Fl-lel kezeltük. Az Fl jel a SAM-ban mindenhol megoszlott, beleértve a központi régiót és a primordiumot is, bár alacsonyabb intenzitással (4j. ábra és 10d. kiegészítő ábra). Ezzel szemben mindhárom GA-Fl specifikusan a primordium határain belül és változó mértékben az IPR többi részében akkumulálódott, a GA7-Fl az IPR legnagyobb doménjében akkumulálódott (4k. ábra és 10a.,b. kiegészítő ábra). A fluoreszcencia intenzitásának számszerűsítése kimutatta, hogy az IPR és a nem IPR intenzitás aránya magasabb volt a GA-Fl-lel kezelt SAM-ban az Fl-lel kezelt SAM-hoz képest (4l. ábra és 10c. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a GA nagyobb koncentrációban van jelen azokban az IPR sejtekben, amelyek a szervhatárhoz legközelebb helyezkednek el. Ez arra utal, hogy a SAM GA jelátviteli aktivitásának mintázata a GA receptorok eltérő expressziójából és a GA eltérő felhalmozódásából ered a szervhatárok közelében lévő IPR sejtekben. Elemzésünk tehát a GA-jelátvitel váratlan térbeli-időbeli mintázatát tárta fel, alacsonyabb aktivitással a SAM központjában és primordiumában, valamint magasabb aktivitással a perifériás régió IPR-jében.
A differenciális GA jelátviteli aktivitás SAM-ban betöltött szerepének megértéséhez elemeztük a GA jelátviteli aktivitás, a sejtszaporodás és a sejtosztódás közötti összefüggést a SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS valós idejű időzített képalkotásával. Tekintettel a GA növekedésszabályozásban betöltött szerepére, várható volt a pozitív korreláció a sejtszaporodási paraméterekkel. Ezért először összehasonlítottuk a GA jelátviteli aktivitási térképeket a sejtfelszíni növekedési sebesség térképeivel (mint egy adott sejt és az osztódáskor lévő leánysejtek sejtszaporodásának erősségének közelítő értékét), valamint a növekedési anizotrópia térképeivel, amelyek a sejtszaporodás irányultságát mérik (itt is egy adott sejt és az osztódáskor lévő leánysejtek esetében használjuk; 5a.,b. ábra, lásd Módszerek és Kiegészítő módszerek). A SAM sejtfelszíni növekedési sebességéről szóló térképeink összhangban vannak a korábbi megfigyelésekkel38,39, minimális növekedési sebességgel a határon és maximális növekedési sebességgel a fejlődő virágokban (5a. ábra). A főkomponens-analízis (PCA) kimutatta, hogy a GA jelátviteli aktivitás negatív korrelációt mutatott a sejtfelszíni növekedési intenzitással (5c. ábra). Azt is kimutattuk, hogy a variáció fő tengelyei, beleértve a GA-jelátviteli bemenetet és a növekedési intenzitást, merőlegesek voltak a magas CLV3-expresszió által meghatározott irányra, megerősítve a sejtek kizárását a SAM-központból a fennmaradó elemzésekben. A Spearman-korrelációs analízis megerősítette a PCA eredményeket (5d. ábra), jelezve, hogy a magasabb GA-jelátvitel az IPR-ben nem eredményezett nagyobb sejtszaporodást. A korrelációs analízis azonban enyhe pozitív korrelációt mutatott a GA-jelátviteli aktivitás és a növekedési anizotrópia között (5c., d. ábra), ami arra utal, hogy a magasabb GA-jelátvitel az IPR-ben befolyásolja a sejtnövekedés irányát és esetleg a sejtosztódási sík helyzetét is.
a, b A SAM átlagos felszíni növekedésének (a) és növekedési anizotrópiájának (b) hőtérképei hét független növény átlagában (a sejtszaporodás erősségének és irányának közelítő értékként használva). c A PCA elemzés a következő változókat tartalmazta: GA-jel, felszíni növekedési intenzitás, felszíni növekedési anizotrópia és CLV3 expresszió. A PCA 1. komponense főként negatív korrelációt mutatott a felszíni növekedési intenzitással és pozitív korrelációt a GA-jellel. A PCA 2. komponens főként pozitív korrelációt mutatott a felszíni növekedési anizotrópiával és negatív korrelációt a CLV3 expresszióval. A százalékos értékek az egyes komponensek által magyarázott variációt jelentik. d Spearman-korrelációs analízis a GA-jel, a felszíni növekedési intenzitás és a felszíni növekedési anizotrópia között szöveti léptékben, a CZ kivételével. A jobb oldali szám a két változó közötti Spearman rho-érték. A csillagok azokat az eseteket jelzik, ahol a korreláció/negatív korreláció erősen szignifikáns. e A Col-0 SAM L1 sejtek 3D-s vizualizációja konfokális mikroszkóppal. A SAM-ban (de nem a primordiumban) 10 óra elteltével kialakult új sejtfalakat a szögértékeiknek megfelelően színeztük. A színsáv a jobb alsó sarokban látható. A betét a megfelelő 3D-s képet mutatja 0 óránál. A kísérletet kétszer megismételtük hasonló eredményekkel. f A dobozdiagramok a sejtosztódási rátákat mutatják IPR és nem IPR Col-0 SAM-ban (n = 10 független növény). A középső vonal a mediánt, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilist jelzik. A bajuszvonalak az R szoftverrel meghatározott minimum és maximum értékeket jelzik. A P-értékeket Welch-féle kétoldalú t-próbával kaptuk meg. g, h Vázlatos ábra, amely bemutatja (g) az új sejtfal (bíborvörös) szögének mérését a SAM középpontjától számított radiális irányhoz képest (fehér szaggatott vonal) (csak a hegyesszögértékeket, azaz a 0–90°-ot vesszük figyelembe), és (h) a merisztémán belüli kerületi/laterális és radiális irányokat. i A sejtosztódási sík orientációjának gyakorisági hisztogramjai a SAM-on (sötétkék), az IPR-en (középkék) és a nem IPR-en (világoskék) keresztül. A P-értékeket kétoldali Kolmogorov-Smirnov teszttel kaptuk. A kísérletet kétszer megismételtük, hasonló eredményekkel. j Az IPR sejtosztódási síkjának orientációját ábrázoló gyakorisági hisztogramok a P3 (világoszöld), P4 (közepesen zöld) és P5 (sötétzöld) körül. A P-értékeket kétoldali Kolmogorov-Smirnov teszttel kaptuk. A kísérletet kétszer megismételtük, hasonló eredményekkel.
Ezért a következő lépésként a GA-jelátvitel és a sejtosztódási aktivitás közötti összefüggést vizsgáltuk az újonnan kialakult sejtfalak azonosításával a vizsgálat során (5e. ábra). Ez a megközelítés lehetővé tette számunkra a sejtosztódás gyakoriságának és irányának mérését. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az IPR-ben és a SAM többi részében (nem IPR, 5f. ábra) a sejtosztódások gyakorisága hasonló volt, ami azt jelzi, hogy az IPR és a nem IPR sejtek közötti GA-jelátvitelbeli különbségek nem befolyásolják szignifikánsan a sejtosztódást. Ez, valamint a GA-jelátvitel és a növekedési anizotrópia közötti pozitív korreláció arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk, vajon a GA-jelátviteli aktivitás befolyásolhatja-e a sejtosztódási sík orientációját. Megmértük az új sejtfal orientációját hegyesszögben a merisztéma középpontját és az új sejtfal középpontját összekötő radiális tengelyhez képest (5e-i. ábra), és egyértelmű tendenciát figyeltünk meg a sejtek radiális tengelyhez viszonyított 90°-hoz közeli szögben történő osztódására, a legmagasabb gyakoriságot 70–80° (23,28%) és 80–90° (22,62%) között figyeltük meg (5e.,i. ábra), ami a kerületi/keresztirányú sejtosztódásoknak felel meg (5h. ábra). A GA-jelátvitel ezen sejtosztódási viselkedéshez való hozzájárulásának vizsgálatához külön elemeztük a sejtosztódási paramétereket az IPR és a nem IPR területeken (5i. ábra). Megfigyeltük, hogy az IPR sejtek osztódási szögének eloszlása eltért a nem IPR sejtekétől vagy a teljes SAM sejtjeitől, az IPR sejtekben nagyobb arányban fordultak elő laterális/cirkuláris sejtosztódások, azaz 70–80° és 80–90° (33,86%, illetve 30,71%, a megfelelő arányok) (5i. ábra). Így megfigyeléseink összefüggést mutattak ki a magas GA-jelátvitel és a kerületi irányhoz közeli sejtosztódási sík orientációja között, hasonlóan a GA-jelátviteli aktivitás és a növekedési anizotrópia közötti korrelációhoz (5c., d. ábra). Ennek az összefüggésnek a térbeli konzerváltságát további megerősítés céljából megmértük az osztódási sík orientációját a primordiumot körülvevő IPR sejtekben a P3-tól kezdődően, mivel a legmagasabb GA-jelátviteli aktivitást ebben a régióban detektáltuk a P4-től kezdődően (4. ábra). Az IPR P3 és P4 körüli osztódási szögei nem mutattak statisztikailag szignifikáns különbségeket, bár a P4 körüli IPR-ben a laterális sejtosztódások gyakoriságának növekedését figyeltük meg (5j. ábra). A P5 körüli IPR sejtekben azonban a sejtosztódási sík orientációjának különbsége statisztikailag szignifikánssá vált, a transzverzális sejtosztódások gyakoriságának hirtelen növekedésével (5j. ábra). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a GA-jelátvitel szabályozhatja a sejtosztódások orientációját a SAM-ban, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel40,41, amelyek szerint a magas GA-jelátvitel a sejtosztódások laterális orientációját indukálhatja az IPR-ben.
Az előrejelzések szerint az IPR sejtjei nem a primordiumokba, hanem az internódiumokba épülnek be2,42,43. Az IPR sejtosztódásainak transzverzális orientációja az epidermális sejtek párhuzamos hosszanti sorainak tipikus szerveződését eredményezheti az internódiumokban. A fent leírt megfigyeléseink arra utalnak, hogy a GA-jelátvitel valószínűleg szerepet játszik ebben a folyamatban a sejtosztódás irányának szabályozásával.
Több DELLA gén funkcióvesztése konstitutív GA-választ eredményez, és a della mutánsok felhasználhatók ennek a hipotézisnek a tesztelésére44. Először öt DELLA gén expressziós mintázatát elemeztük a SAM-ban. A GUS vonal transzkripciós fúziója45 kimutatta, hogy a GAI, RGA, RGL1 és RGL2 (sokkal kisebb mértékben) expresszálódott a SAM-ban (11a–d. kiegészítő ábra). Az in situ hibridizáció továbbá kimutatta, hogy a GAI mRNS specifikusan a primordiumokban és a fejlődő virágokban halmozódik fel (11e. kiegészítő ábra). Az RGL1 és RGL3 mRNS-t a SAM lombkoronájában és az idősebb virágokban is kimutatták, míg az RGL2 mRNS a határvidéken volt nagyobb mennyiségben jelen (11f–h. kiegészítő ábra). A pRGL3::RGL3-GFP SAM konfokális képalkotása megerősítette az in situ hibridizációval megfigyelt expressziót, és kimutatta, hogy az RGL3 fehérje a SAM központi részében halmozódik fel (11i. kiegészítő ábra). A pRGA::GFP-RGA vonal használatával azt is megállapítottuk, hogy az RGA fehérje felhalmozódik a SAM-ban, de a P4-től kezdődően a határon csökken a mennyisége (11j. kiegészítő ábra). Figyelemre méltó, hogy az RGL3 és az RGA expressziós mintázatai összhangban vannak a qmRGA által kimutatott magasabb GA jelátviteli aktivitással az IPR-ben (4. ábra). Továbbá ezek az adatok azt jelzik, hogy az összes DELLA expresszálódik a SAM-ban, és hogy expressziójuk együttesen kiterjed a teljes SAM-ra.
Ezután elemeztük a sejtosztódási paramétereket a vad típusú SAM-ban (Ler, kontroll) és a gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della ötös (globális) mutánsokban (6a., b. ábra). Érdekes módon statisztikailag szignifikáns eltolódást figyeltünk meg a sejtosztódási szögek gyakoriságának eloszlásában a della global mutáns SAM-ban a vad típushoz képest (6c. ábra). Ez a változás a della global mutánsban a 80–90°-os szögek gyakoriságának növekedésének (34,71% vs. 24,55%), és kisebb mértékben a 70–80°-os szögek gyakoriságának (23,78% vs. 20,18%) volt köszönhető, azaz ez megfelel a transzverzális sejtosztódásoknak (6c. ábra). A nem transzverzális osztódások (0–60°) gyakorisága szintén alacsonyabb volt a della global mutánsban (6c. ábra). A transzverzális sejtosztódások gyakorisága szignifikánsan megnőtt a della global mutáns SAM-jában (6b. ábra). Az IPR-ben a transzverzális sejtosztódások gyakorisága szintén magasabb volt a della global mutánsban a vad típushoz képest (6d. ábra). Az IPR régión kívül a vad típus egyenletesebb sejtosztódási szögek eloszlását mutatta, míg a della global mutáns az IPR-hez hasonlóan a tangenciális osztódásokat részesítette előnyben (6e. ábra). Meghatároztuk a sejtosztódások orientációját a ga2-oxidáz (ga2ox) ötös mutánsok (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 és ga2ox6-2) SAM-jában is, amely egy GA-inaktív mutáns háttér, amelyben a GA felhalmozódik. A GA-szintek növekedésével összhangban az ötös ga2ox mutáns virágzatának SAM-értéke nagyobb volt, mint a Col-0-é (12a., b. kiegészítő ábra), és a Col-0-hoz képest az ötös ga2ox SAM a sejtosztódási szögek eloszlásában határozottan eltérő volt, a szöggyakoriság 50°-ról 90°-ra nőtt, azaz ismét a tangenciális osztódásoknak kedvezett (12a–c. kiegészítő ábra). Így megmutatjuk, hogy a GA-jelátvitel konstitutív aktiválása és a GA-felhalmozódás laterális sejtosztódást indukál az IPR-ben és a SAM többi részében.
a, b A PI-vel festett Ler (a) és a globális della mutáns (b) SAM L1 rétegének 3D-s vizualizációja konfokális mikroszkóppal. A SAM-ban (de nem a primordiumban) 10 óra alatt kialakult új sejtfalak láthatók, és a szögértékeiknek megfelelően színezve. A betét a SAM-ot mutatja 0 óránál. A színsáv a jobb alsó sarokban látható. A (b) ábrán látható nyíl a globális della mutánsban lévő igazított sejtfájlok egy példájára mutat. A kísérletet kétszer megismételtük hasonló eredményekkel. ce a sejtosztódási sík orientációinak gyakorisági eloszlásának összehasonlítása a teljes SAM-ban (d), IPR-ben (e) és nem IPR-ben (f) a Ler és a globális della között. A P-értékeket kétoldalú Kolmogorov-Smirnov teszttel kaptuk meg. f, g A Col-0 (i) és pCUC2::gai-1-VENUS (j) transzgénikus növények PI-vel festett SAM-jának konfokális képeinek 3D-s vizualizációja. Az (a, b) panelek a SAM-ban 10 órán belül kialakult új sejtfalakat (de nem primordiumokat) mutatják. A kísérletet kétszer megismételtük hasonló eredményekkel. h–j A teljes SAM-ban (h), IPR-ben (i) és nem IPR-ben (j) található sejtosztódási sík orientációk gyakorisági eloszlásának összehasonlítása a Col-0 és a pCUC2::gai-1-VENUS növények között. A P-értékeket kétoldali Kolmogorov–Smirnov teszttel kaptuk meg.
Ezután teszteltük a GA-jelátvitel gátlásának hatását specifikusan az IPR-ben. Ennek érdekében a sziklevél cup 2 (CUC2) promótert használtuk a VENUS-hoz fuzionált domináns negatív gai-1 fehérje expressziójának serkentésére (a pCUC2::gai-1-VENUS sejtvonalban). A vad típusú SAM-ban a CUC2 promóter a legtöbb IPR expresszióját serkenti a SAM-ban, beleértve a határsejteket is, a P4-től kezdődően, és hasonló specifikus expressziót figyeltünk meg a pCUC2::gai-1-VENUS növényekben (lásd alább). A sejtosztódási szögek eloszlása a pCUC2::gai-1-VENUS növények SAM-ján vagy IPR-jén nem különbözött szignifikánsan a vad típusétól, bár váratlanul azt tapasztaltuk, hogy ezekben a növényekben az IPR nélküli sejtek magasabb, 80–90°-os gyakorisággal osztódtak (6f–j. ábra).
Felmerült, hogy a sejtosztódás iránya a SAM geometriájától függ, különösen a szövet görbülete által generált szakítófeszültségtől46. Ezért azt vizsgáltuk, hogy megváltozott-e a SAM alakja a della global mutáns és a pCUC2::gai-1-VENUS növényekben. Amint azt korábban közöltük12, a della global mutáns SAM mérete nagyobb volt, mint a vad típusé (13a., b., d. kiegészítő ábra). A CLV3 és az STM RNS in situ hibridizációja megerősítette a merisztéma expanzióját a della mutánsokban, és továbbá kimutatta az őssejt-niche laterális terjeszkedését (13e., f., h., i. kiegészítő ábra). A SAM görbülete azonban mindkét genotípusban hasonló volt (13k., m., n., p. kiegészítő ábra). Hasonló méretnövekedést figyeltünk meg a gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della négyszeres mutánsban a görbület változása nélkül a vad típushoz képest (13c., d., g., j., l., o., p. kiegészítő ábra). A sejtosztódás orientációjának gyakorisága is változott a della négyszeres mutánsban, de kisebb mértékben, mint a della monolitikus mutánsban (12d–f. kiegészítő ábra). Ez a dózishatás, a görbületre gyakorolt hatás hiányával együtt, arra utal, hogy a Della négyszeres mutánsban a maradék RGL3 aktivitás korlátozza a DELLA aktivitás elvesztése által okozott sejtosztódási orientáció változásait, és hogy az oldalirányú sejtosztódások változásai a GA jelátviteli aktivitás változásaira, nem pedig a SAM geometriájának változásaira adott válaszként jelentkeznek. Amint azt fentebb leírtuk, a CUC2 promoter az IPR expresszióját hajtja a SAM-ban, a P4-től kezdve (14a., b. kiegészítő ábra), és ezzel szemben a pCUC2::gai-1-VENUS SAM mérete csökkent, de görbülete nagyobb volt (14c–h. kiegészítő ábra). A pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfológiájának ez a változása a mechanikai feszültségek eltérő eloszlását eredményezheti a vad típushoz képest, amelyben a nagy kerületi feszültségek a SAM középpontjától rövidebb távolságra kezdődnek47. Alternatív megoldásként a pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfológiájának változásai a transzgén expressziója által kiváltott regionális mechanikai tulajdonságok változásaiból eredhetnek48. Mindkét esetben ez részben ellensúlyozhatja a GA-jelátvitel változásainak hatásait azáltal, hogy növeli annak valószínűségét, hogy a sejtek kerületi/transzverzális orientációban osztódnak, ami magyarázza megfigyeléseinket.
Összefoglalva, adataink megerősítik, hogy a magasabb GA-jelátvitel aktív szerepet játszik a sejtosztódási sík laterális orientációjában az IPR-ben. Azt is mutatják, hogy a merisztéma görbülete szintén befolyásolja a sejtosztódási sík orientációját az IPR-ben.
Az IPR-ben az osztódási sík transzverzális orientációja, a magas GA-jelátviteli aktivitás miatt, arra utal, hogy a GA előre szervezi a radiális sejtállományt az epidermiszben a SAM-on belül, hogy meghatározza azt a sejtes szerveződést, amely később az epidermális internodumban található meg. Valójában az ilyen sejtállományok gyakran láthatóak voltak a della global mutánsok SAM-képein (6b. ábra). Így, hogy tovább vizsgáljuk a GA-jelátvitel térbeli mintázatának fejlődési funkcióját a SAM-ban, időzített képalkotást alkalmaztunk a sejtek térbeli szerveződésének elemzésére az IPR-ben vad típusú (Ler és Col-0), della global mutánsok és pCUC2::gai-1-VENUS transzgénikus növényekben.
Azt tapasztaltuk, hogy a qmRGA azt mutatta, hogy a GA jelátviteli aktivitás az IPR-ben a P1/P2-től a P4-nél tetőzött, és ez a minta idővel állandó maradt (4a–f. ábra és 8c–f., k. kiegészítő ábra). Az IPR-ben a sejtek térbeli szerveződésének elemzéséhez a növekvő GA jellel a P4 felett és mellett az Ler IPR sejteket a P4-től eltérő fejlődési sorsuk szerint jelöltük meg, amelyet az első megfigyelés után 34 órával elemeztünk, azaz több mint két plasztididő alatt, lehetővé téve számunkra, hogy az IPR sejteket a primordium fejlődése során követhessük a P1/P2-től a P4-ig. Három különböző színt használtunk: sárgát azokhoz a sejtekhez, amelyek a P4 közelében integrálódtak a primordiumba, zöldet azokhoz, amelyek az IPR-ben voltak, és lilát azokhoz, amelyek mindkét folyamatban részt vettek (7a–c. ábra). A t0-nál (0 óra) 1-2 réteg IPR sejt volt látható a P4 előtt (7a. ábra). Ahogy az várható volt, amikor ezek a sejtek osztódtak, azt főként a transzverzális osztódási síkon keresztül tették (7a–c. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a Col-0 SAM használatával (a P3-ra összpontosítva, amelynek szegélye hasonlóan redődött, mint a P4 a Lerben), bár ebben a genotípusban a virágzat szegélyénél kialakult redő gyorsabban elrejtette az IPR sejteket (7g–i. ábra). Így az IPR sejtek osztódási mintázata a sejteket radiális sorokba előre szervezi, az internódiumokhoz hasonlóan. A radiális sorok szerveződése és az IPR sejtek lokalizációja az egymást követő szervek között arra utal, hogy ezek a sejtek internodális progenitorok.
Itt kifejlesztettünk egy ratiometrikus GA jelátviteli bioszenzort, a qmRGA-t, amely lehetővé teszi a kombinált GA és GA receptor koncentrációkból eredő GA jelátviteli aktivitás kvantitatív feltérképezését, miközben minimalizálja az endogén jelátviteli útvonalakkal való interferenciát, ezáltal információt nyújt a GA sejtszintű működéséről. Ennek érdekében konstruáltunk egy módosított DELLA fehérjét, az mRGA-t, amely elvesztette a DELLA interakciós partnerekhez való kötődés képességét, de érzékeny marad a GA által indukált proteolízisre. A qmRGA mind a GA-szintek exogén, mind endogén változásaira reagál, és dinamikus érzékelő tulajdonságai lehetővé teszik a GA jelátviteli aktivitás térbeli és időbeli változásainak értékelését a fejlődés során. A qmRGA egy nagyon rugalmas eszköz is, mivel a expressziójához használt promóter megváltoztatásával (szükség esetén) különböző szövetekhez adaptálható, és a GA jelátviteli útvonal konzervált jellege és a PFYRE motívum zárvatermőkön keresztüli jelenléte miatt valószínűleg más fajokra is átvihető22. Ezzel összhangban egy ekvivalens mutáció a rizs SLR1 DELLA fehérjében (HYY497AAA) szintén kimutatta, hogy gátolja az SLR1 növekedést represszor aktivitását, miközben csak kis mértékben csökkenti a GA-közvetített lebontását, hasonlóan az mRGA23-hoz. Figyelemre méltó, hogy az Arabidopsisban végzett újabb vizsgálatok kimutatták, hogy a PFYRE doménben egyetlen aminosav-mutáció (S474L) megváltoztatta az RGA transzkripciós aktivitását anélkül, hogy befolyásolta volna a transzkripciós faktor partnerekkel való kölcsönhatásának képességét50. Bár ez a mutáció nagyon közel áll az mRGA-ban jelen lévő 3 aminosav-szubsztitúcióhoz, tanulmányaink azt mutatják, hogy ez a két mutáció a DELLA eltérő jellemzőit megváltoztatja. Bár a legtöbb transzkripciós faktor partner a DELLA26,51 LHR1 és SAW doménjeihez kötődik, a PFYRE doménben található néhány konzervált aminosav segíthet stabilizálni ezeket a kölcsönhatásokat.
Az internódium fejlődése kulcsfontosságú tulajdonság a növényi architektúrában és a terméshozam növelésében. A qmRGA magasabb GA jelátviteli aktivitást mutatott ki az IPR internódium progenitor sejtekben. A kvantitatív képalkotás és a genetika kombinálásával kimutattuk, hogy a GA jelátviteli mintázatok a SAM epidermiszében a körkörös/transzverzális sejtosztódási síkokra helyeződnek, alakítva az internódium fejlődéséhez szükséges sejtosztódási szerveződést. A fejlődés során a sejtosztódási sík orientációjának számos szabályozóját azonosították52,53. Munkánk egyértelmű példát mutat arra, hogy a GA jelátviteli aktivitás hogyan szabályozza ezt a sejtes paramétert. A DELLA kölcsönhatásba léphet az előtekeredő fehérjekomplexekkel41, így a GA jelátvitel szabályozhatja a sejtosztódási sík orientációját a kéreg mikrotubulusainak orientációjának közvetlen befolyásolásával40,41,54,55. Váratlanul kimutattuk, hogy a SAM-ban a magasabb GA jelátviteli aktivitás korrelátuma nem a sejtek megnyúlása vagy osztódása volt, hanem csak a növekedési anizotrópia, ami összhangban van a GA közvetlen hatásával a sejtosztódás irányára az IPR-ben. Azonban nem zárhatjuk ki, hogy ez a hatás közvetett is lehet, például a GA által kiváltott sejtfallágyulás közvetítheti56. A sejtfal tulajdonságainak változásai mechanikai stresszt okoznak57,58, ami a kérgi mikrotubulusok orientációjának befolyásolásával a sejtosztódási sík orientációját is befolyásolhatja39,46,59. A GA által kiváltott mechanikai stressz és a GA általi mikrotubulus-orientáció közvetlen szabályozásának együttes hatása szerepet játszhat a sejtosztódás orientációjának egy specifikus mintázatának kialakításában az IPR-ben, az internódiumok meghatározásához, és további vizsgálatokra van szükség ennek az elképzelésnek a teszteléséhez. Hasonlóképpen, korábbi tanulmányok kiemelték a DELLA-val kölcsönhatásba lépő TCP14 és 15 fehérjék fontosságát az internódiumképződés szabályozásában60,61, és ezek a faktorok közvetíthetik a GA hatását a BREVIPEDICELLUS (BP) és a PENNYWISE (PNY) fajokkal együtt, amelyek szabályozzák az internódiumfejlődést, és kimutatták, hogy befolyásolják a GA jelátvitelét2,62. Tekintettel arra, hogy a DELLA-k kölcsönhatásba lépnek a brasszinoszteroid, etilén, jázmonsav és abszcizinsav (ABA) jelátviteli útvonalakkal63,64, és hogy ezek a hormonok befolyásolhatják a mikrotubulusok orientációját65, a GA sejtosztódási orientációra gyakorolt hatását más hormonok is közvetíthetik.
Korai citológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az Arabidopsis SAM belső és külső régiói egyaránt szükségesek az internódium fejlődéséhez2,42. Az a tény, hogy a GA aktívan szabályozza a sejtosztódást a belső szövetekben12, alátámasztja a GA kettős funkcióját a merisztéma és az internódium méretének szabályozásában a SAM-ban. Az irányított sejtosztódás mintázata szintén szigorúan szabályozott a belső SAM szövetben, és ez a szabályozás elengedhetetlen a szár növekedéséhez52. Érdekes lesz megvizsgálni, hogy a GA szerepet játszik-e a sejtosztódási sík orientálásában a belső SAM-szerveződésben is, ezáltal szinkronizálva az internódiumok specifikációját és fejlődését a SAM-on belül.
A növényeket in vitro talajban vagy 1% szacharózt és 1% agart (Sigma) tartalmazó 1x Murashige-Skoog (MS) táptalajon (Duchefa) neveltük standard körülmények között (16 óra fény, 22 °C), kivéve a hipokotil- és gyökérnövekedési kísérleteket, amelyekben a palántákat függőleges tányérokon, állandó fényben és 22 °C-on neveltük. A nitrátkísérletekhez a növényeket módosított MS táptalajon (bioWORLD növényi táptalajon) neveltük, megfelelő nitráttal (0 vagy 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-szukcináttal, 1% szacharózzal és 1% A-agarral (Sigma), hosszúnappalos körülmények között.
A pDONR221-be inszertált GID1a cDNS-t rekombinálták pDONR P4-P1R-pUBQ10-zel és pDONR P2R-P3-mCherry-vel a pB7m34GW-ben, így létrehozva a pUBQ10::GID1a-mCherry-t. A pDONR221-be inszertált IDD2 DNS-t rekombinálták pB7RWG266-ban, így létrehozva a p35S:IDD2-RFP-t. A pGID1b::2xmTQ2-GID1b létrehozásához először a GID1b kódoló régiótól felfelé elhelyezkedő 3,9 kb hosszúságú fragmenst, valamint a GID1b cDNS-t (1,3 kb) és terminátort (3,4 kb) tartalmazó 4,7 kb hosszúságú fragmenst amplifikáltuk a 3. kiegészítő táblázatban található primerek segítségével, majd beillesztettük a pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific), illetve a pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) plazmidokba, végül pedig a pDONR221 2xmTQ268 plazmiddal rekombináltuk a pGreen 012567 célvektorba Gateway klónozással. A pCUC2::LSSmOrange létrehozásához a CUC2 promóter szekvenciáját (3229 bp az ATG előtt), majd a nagy Stokes-eltolódott mOrange (LSSmOrange)69 kódoló szekvenciáját az N7 nukleáris lokalizációs szignállal és a NOS transzkripciós terminátorral a Gateway 3-fragment rekombinációs rendszer (Invitrogen) segítségével a pGreen kanamicin célzó vektorba állítottuk be. A növényi bináris vektort Agrobacterium tumefaciens GV3101 törzsbe vittük be, majd Agrobacterium infiltrációs módszerrel Nicotiana benthamiana levelekbe, illetve virágbemártásos módszerrel Arabidopsis thaliana Col-0-ba. A pUBQ10::qmRGA, a pUBQ10::GID1a-mCherry és a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA plazmidokat a megfelelő keresztezések F3 és F1 utódaiból izoláltuk.
Az RNS in situ hibridizációt körülbelül 1 cm hosszú hajtásvégeken72 végeztük, amelyeket összegyűjtöttünk, majd azonnal fixáltunk 4 °C-ra előhűtött FAA oldatban (3,7% formaldehid, 5% ecetsav, 50% etanol). 2 × 15 perces vákuumkezelések után a fixálószert lecseréltük, és a mintákat egy éjszakán át inkubáltuk. A GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 és RGL3 cDNS-eket és a 3′-UTR-jeikhez kapcsolódó antiszensz próbákat a 3. kiegészítő táblázatban bemutatott primerek segítségével szintetizáltuk Rosier és munkatársai73 által leírtak szerint. A digoxigeninnel jelölt próbákat digoxigenin antitestekkel (3000-szeres hígítás; Roche, katalógusszám: 11 093 274 910) immunológiailag detektálták, és a metszeteket 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (BCIP, 250-szeres hígítás)/nitrokéke tetrazólium (NBT, 200-szoros hígítás) oldattal festették.
Közzététel ideje: 2025. február 10.