Az apikális merisztéma (SAM) növekedése kritikus a szár architektúrája szempontjából. Növényi hormonokgibberellinek(GA-k) kulcsszerepet játszanak a növények növekedésének koordinálásában, de szerepük a SAM-ban továbbra is kevéssé ismert. Itt kifejlesztettük a GA jelátvitel ratiometrikus bioszenzorát a DELLA fehérje megtervezésével, hogy elnyomja annak alapvető szabályozó funkcióját a GA transzkripciós válaszában, miközben megőrzi a GA felismeréskor bekövetkező lebomlását. Bemutatjuk, hogy ez a lebomláson alapuló bioszenzor pontosan rögzíti a GA-szintek változásait és a sejt érzékelését a fejlesztés során. Ezt a bioszenzort használtuk a GA jelátviteli tevékenység feltérképezésére a SAM-ban. Megmutatjuk, hogy a magas GA jelek túlnyomórészt a szerv primordiumai között elhelyezkedő sejtekben vannak jelen, amelyek a csomóközi sejtek prekurzorai. Funkciónövekedési és -vesztési megközelítésekkel bemutatjuk továbbá, hogy a GA szabályozza a sejtosztódási sík orientációját, létrehozva az internódiumok kanonikus sejtszerveződését, ezáltal elősegítve az internode specifikációt a SAM-ban.
A hajtáscsúcson található hajtáscsúcs merisztéma (SAM) olyan őssejtek rést tartalmaz, amelyek tevékenysége oldalsó szerveket és szárcsomókat generál modulárisan és iteratív módon a növény élete során. Ezen ismétlődő egységek vagy növényi csomópontok mindegyike internódiumokat és oldalsó szerveket tartalmaz a csomópontoknál, valamint hónaljmerisztémákat a levél hónaljaiban1. A növényi csomópontok növekedése és szerveződése a fejlődés során megváltozik. Az Arabidopsis-ban az internodális növekedés a vegetatív szakaszban elnyomott, és a hónaljmerisztémák a rozettalevelek hónaljában alvó állapotban maradnak. A virágzási fázisba való átmenet során a SAM virágzati merisztémává válik, amely megnyúlt internódiumokat és hónaljrügyeket, ágakat hoz létre a kalászos levelek hónaljában, majd később levéltelen virágokat2. Bár jelentős előrelépést értünk el a levelek, virágok és ágak beindulását szabályozó mechanizmusok megértésében, viszonylag keveset tudunk arról, hogyan keletkeznek a csomópontok.
A GA-k spatiotemporális eloszlásának megértése segít jobban megérteni e hormonok funkcióit a különböző szövetekben és különböző fejlődési szakaszokban. Az RGA-GFP fúzió saját promóterének hatására kifejezett degradációjának vizualizálása fontos információkat szolgáltat a gyökerekben lévő teljes GA-szint szabályozásáról15,16. Az RGA expressziója azonban szövetenként változik17, és a GA18 szabályozza. Így az RGA promoter eltérő expressziója az RGA-GFP-vel megfigyelt fluoreszcencia mintázatot eredményezhet, így ez a módszer nem kvantitatív. A közelmúltban a bioaktív fluoreszceinnel (Fl) jelölt GA19,20 kimutatta a GA felhalmozódását a gyökér endokortexében, és sejtszintjének szabályozását a GA transzport révén. Nemrég a GA FRET érzékelő nlsGPS1 kimutatta, hogy a GA szintek korrelálnak a sejtmegnyúlással a gyökerekben, a filamentumokban és a sötétben növesztett hipokotilokban21. Azonban, mint láttuk, a GA koncentráció nem az egyetlen GA jelátviteli aktivitást szabályozó paraméter, mivel ez összetett érzékelési folyamatoktól függ. Itt a DELLA és GA jelátviteli útvonalak megértésére építve beszámolunk egy lebomláson alapuló ratiometrikus bioszenzor kifejlesztéséről és jellemzéséről a GA jelátvitelhez. Ennek a kvantitatív bioszenzornak a kifejlesztéséhez egy mutáns GA-érzékeny RGA-t használtunk, amelyet egy fluoreszcens fehérjével fuzionáltunk, és mindenütt expresszálódnak a szövetekben, valamint egy GA-érzékeny fluoreszcens fehérjét. Megmutatjuk, hogy a mutáns RGA fehérje fúziók nem zavarják az endogén GA jelátvitelt, ha mindenütt expresszálódnak, és hogy ez a bioszenzor képes számszerűsíteni a GA bemenetből és a GA jelfeldolgozásból eredő jelátviteli aktivitást, nagy térbeli és időbeli felbontással. Ezzel a bioszenzorral feltérképeztük a GA jelátviteli aktivitás spatiotemporális eloszlását, és számszerűsítettük, hogy a GA hogyan szabályozza a sejt viselkedését a SAM epidermiszben. Bemutatjuk, hogy a GA szabályozza a szervi primordiumok között elhelyezkedő SAM-sejtek osztódási síkjának orientációját, ezáltal meghatározza az internódium kanonikus sejtszerveződését.
Végül megkérdeztük, hogy a qmRGA beszámolhat-e az endogén GA-szintek változásairól növekvő hipokotilok használatával. Korábban kimutattuk, hogy a nitrát serkenti a növekedést azáltal, hogy fokozza a GA szintézist, és viszont a DELLA34 lebomlását. Ennek megfelelően megfigyeltük, hogy a bőséges nitrátellátás mellett (10 mM NO3−) nevelt pUBQ10::qmRGA palánták hipokotil hossza szignifikánsan hosszabb volt, mint a nitráthiányos körülmények között nevelt palántáké (kiegészítő 6a. ábra). A növekedési válasznak megfelelően a GA jelek magasabbak voltak a 10 mM NO3- körülmények között nevelt palánták hipokotiljaiban, mint a nitrát hiányában nevelt palántákban (kiegészítő 6b, c ábra). Így a qmRGA a GA-koncentráció endogén változásai által kiváltott GA jelátviteli változások nyomon követését is lehetővé teszi.
Annak megértéséhez, hogy a qmRGA által kimutatott GA jelátviteli aktivitás függ-e a GA koncentrációjától és a GA észlelésétől, ahogy az a szenzor tervezése alapján várható volt, elemeztük a három GID1 receptor expresszióját a vegetatív és reproduktív szövetekben. A palántákon a GID1-GUS riportervonal azt mutatta, hogy a GID1a és c erősen expresszálódik a sziklevelekben (3a–c. ábra). Ezenkívül mindhárom receptor kifejeződött a levelekben, az oldalsó gyökérprimordiumokban, a gyökércsúcsokban (kivéve a GID1b gyökérsapkáját) és az érrendszerben (3a–c. ábra). A virágzat SAM-ban csak a GID1b és 1c esetében észleltünk GUS jeleket (7a–c kiegészítő ábra). Az in situ hibridizáció megerősítette ezeket az expressziós mintázatokat, és tovább igazolta, hogy a GID1c egyenletesen expresszálódik alacsony szinten a SAM-ban, míg a GID1b magasabb expressziót mutatott a SAM perifériáján (7d–l. kiegészítő ábra). A pGID1b::2xmTQ2-GID1b transzlációs fúzió a GID1b expressziójának fokozatos tartományát is feltárta, a SAM közepén lévő alacsony vagy egyáltalán nem expressziótól a szerv határain lévő magas expresszióig (7m. kiegészítő ábra). Így a GID1 receptorok nem egyenletesen oszlanak el a szövetekben és a szöveteken belül. A következő kísérletekben azt is megfigyeltük, hogy a GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) túlzott expressziója megnövelte a qmRGA érzékenységét a hipokotilokban a külső GA alkalmazásra (3d, e ábra). Ezzel szemben a hipokotilban a qd17mRGA-val mért fluoreszcencia érzéketlen volt a GA3-kezelésre (3f., g. ábra). Mindkét vizsgálat során a palántákat magas koncentrációjú GA-val (100 μM GA3) kezeltük, hogy felmérjük az érzékelő gyors viselkedését, ahol a GID1 receptorhoz való kötődési képesség fokozódott vagy elveszett. Ezek az eredmények együttesen megerősítik, hogy a qmRGA bioszenzor kombinált funkciót lát el GA és GA érzékelőként, és arra utalnak, hogy a GID1 receptor differenciális expressziója jelentősen módosíthatja az érzékelő emissziós képességét.
A mai napig a GA-jelek eloszlása a SAM-ben továbbra is tisztázatlan. Ezért qmRGA-t expresszáló növényeket és a pCLV3::mCherry-NLS őssejt riportert35 használtuk a GA jelátviteli aktivitás nagy felbontású kvantitatív térképeinek kiszámításához, az L1 rétegre (epidermisz; 4a, b ábra, lásd Módszerek és kiegészítő módszerek), mivel az L31 kulcsszerepet játszik a növekedés szabályozásában. Itt a pCLV3::mCherry-NLS expresszió rögzített geometriai referenciapontot adott a GA jelátviteli aktivitás spatiotemporális eloszlásának elemzéséhez37. Bár a GA-t az oldalsó szervfejlődéshez nélkülözhetetlennek tartják4, megfigyeltük, hogy a GA jelek alacsonyak voltak a virág primordiumban (P) a P3 stádiumtól kezdve (4a, b ábra), míg a fiatal P1 és P2 primordiumok mérsékelt aktivitással rendelkeznek, hasonlóan a központi régióhoz (4a, b ábra). Magasabb GA jelátviteli aktivitást észleltünk a szerv primordium határain, kezdve a P1/P2-től (a határ oldalain) és a P4-nél tetőzve, valamint a primordiumok között elhelyezkedő perifériás régió összes sejtjében (4a, b ábra és kiegészítő 8a, b ábra). Ez a magasabb GA jelátviteli aktivitás nemcsak az epidermiszben, hanem az L2 és a felső L3 rétegben is megfigyelhető volt (kiegészítő 8b ábra). A qmRGA segítségével a SAM-ban észlelt GA jelek mintázata szintén változatlan maradt az idő múlásával (8c-f, k kiegészítő ábra). Bár a qd17mRGA konstrukciót szisztematikusan leszabályozták a T3 növények SAM-jában öt független vonalból, amelyeket részletesen jellemeztünk, elemezhettük a pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstrukcióval kapott fluoreszcencia mintákat (kiegészítő 8g-j, l ábra). Ebben a kontrollvonalban a SAM-ban csak kisebb változásokat észleltünk a fluoreszcencia arányban, de a SAM központban a TagBFP-hez kapcsolódó VENUS egyértelmű és váratlan csökkenését figyeltük meg. Ez megerősíti, hogy a qmRGA által megfigyelt jelátviteli mintázat az mRGA-VENUS GA-függő lebomlását tükrözi, de azt is bizonyítja, hogy a qmRGA túlbecsülheti a GA jelátviteli aktivitását a merisztéma központban. Összefoglalva, eredményeink feltárnak egy GA jelátviteli mintát, amely elsősorban a primordiumok eloszlását tükrözi. Az inter-primordiális régió (IPR) ezen eloszlása annak köszönhető, hogy a fejlődő primordium és a központi régió között fokozatosan kialakul a magas GA jelátviteli aktivitás, miközben ezzel egyidejűleg a primordiumban csökken a GA jelátviteli aktivitás (4c, d ábra).
A GID1b és GID1c receptorok eloszlása (lásd fent) arra utal, hogy a GA receptorok eltérő expressziója segít a GA jelátviteli aktivitás mintázatának kialakításában a SAM-ban. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a GA differenciális felhalmozódása szerepet játszhat-e. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára az nlsGPS1 GA FRET érzékelőt21 használtuk. Megnövekedett aktiválási gyakoriságot észleltek a 10 μM GA4+7-tel 100 percig kezelt nlsGPS1 SAM-jában (kiegészítő 9a–e ábra), ami azt jelzi, hogy az nlsGPS1 reagál a SAM-ban bekövetkező GA-koncentráció változásaira, akárcsak a gyökerekben21. Az nlsGPS1 aktiválási gyakoriságának térbeli eloszlása viszonylag alacsony GA szintet mutatott a SAM külső rétegeiben, de azt mutatta, hogy a SAM közepén és határain megemelkedett (4e ábra és kiegészítő 9a, c ábra). Ez arra utal, hogy a GA a SAM-ban is a qmRGA által feltárt térbeli mintázattal oszlik meg. Kiegészítő megközelítésként a SAM-ot negatív kontrollként fluoreszcens GA-val (GA3-, GA4-, GA7-Fl) vagy Fl-vel is kezeltük. Az Fl jel az egész SAM-ban eloszlott, beleértve a központi régiót és a primordiumot, bár alacsonyabb intenzitással (4j. ábra és 10d. kiegészítő ábra). Ezzel szemben mindhárom GA-Fl specifikusan a primordium határain belül halmozódott fel, és különböző mértékben az IPR többi részében, a GA7-Fl pedig az IPR legnagyobb tartományában halmozódott fel (4k ábra és kiegészítő 10a, b ábra). A fluoreszcencia intenzitásának számszerűsítése feltárta, hogy az IPR-nem IPR intenzitás aránya magasabb volt a GA-Fl-vel kezelt SAM-ban, mint az Fl-vel kezelt SAM-ban (4l. ábra és 10c. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a GA nagyobb koncentrációban van jelen azokban az IPR sejtekben, amelyek a legközelebb találhatók a szerv határához. Ez arra utal, hogy a SAM GA jelátviteli aktivitás mintázata a GA receptorok eltérő expressziójából és a GA eltérő felhalmozódásából ered az IPR sejtekben a szervek határai közelében. Így elemzésünk a GA jelátvitel váratlan spatiotemporális mintázatát tárta fel, alacsonyabb aktivitással a SAM központjában és primordiumában, és magasabb aktivitással az IPR-ben a perifériás régióban.
A differenciális GA jelátviteli aktivitás SAM-ban betöltött szerepének megértéséhez elemeztük a GA jelátviteli aktivitás, a sejtterjeszkedés és a sejtosztódás közötti összefüggést a SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS valós idejű time-lapse képalkotásával. Tekintettel a GA növekedésszabályozásban betöltött szerepére, pozitív korreláció várható a sejttágulási paraméterekkel. Ezért először a GA jelátviteli aktivitástérképeket hasonlítottuk össze a sejtfelszíni növekedési sebesség térképeivel (mint egy adott sejt és az osztódáskori leánysejtek sejttágulási erősségének proxyja) és a növekedési anizotrópia térképeivel, amelyek a sejttágulás irányát mérik (itt egy adott metódusra és osztódáskor leánysejtekre is használjuk; 5a,b és kiegészítések). A SAM sejtfelszíni növekedési sebességet ábrázoló térképeink összhangban vannak a korábbi megfigyelésekkel38, 39, minimális növekedési sebességgel a határon, és maximális növekedési sebességgel a fejlődő virágokban (5a. ábra). A főkomponens-analízis (PCA) azt mutatta, hogy a GA jelátviteli aktivitás negatívan korrelált a sejtfelszíni növekedés intenzitásával (5c. ábra). Azt is kimutattuk, hogy a fő variációs tengelyek, beleértve a GA jelátviteli bemenetet és a növekedési intenzitást, ortogonálisak a magas CLV3 expresszió által meghatározott irányra, ami megerősíti a sejtek kizárását a SAM központból a többi elemzésben. A Spearman korrelációs analízis megerősítette a PCA eredményeket (5d. ábra), jelezve, hogy a magasabb GA jelek az IPR-ben nem eredményeztek nagyobb sejtexpanziót. A korrelációs analízis azonban enyhe pozitív korrelációt mutatott ki a GA jelátviteli aktivitás és a növekedési anizotrópia között (5c, d ábra), ami arra utal, hogy a magasabb GA jelátvitel az IPR-ben befolyásolja a sejtnövekedés irányát és esetleg a sejtosztódási sík helyzetét.
a, b Az átlagos felszíni növekedés (a) és a növekedési anizotrópia (b) hőtérképei SAM-ban hét független növényre vonatkoztatva átlagolták (a sejttágulás erősségének és irányának mutatójaként). c A PCA analízis a következő változókat tartalmazta: GA jel, felszíni növekedési intenzitás, felszíni növekedési anizotrópia és CLV3 expresszió. A PCA 1. komponense főként negatívan korrelált a felületi növekedés intenzitásával és pozitívan a GA jellel. A PCA 2. komponense főként pozitívan korrelált a felszíni növekedési anizotrópiával és negatívan a CLV3 expressziójával. A százalékok az egyes komponensek által megmagyarázott eltéréseket jelentik. d Spearman korrelációs elemzés a GA jel, a felületi növekedés intenzitása és a felületi növekedési anizotrópia között a szöveti skálán, a CZ kivételével. A jobb oldali szám a Spearman rho értéke két változó között. A csillagok azokat az eseteket jelölik, amikor a korreláció/negatív korreláció nagyon szignifikáns. e Col-0 SAM L1 sejtek 3D megjelenítése konfokális mikroszkóppal. A SAM-ban (de nem a primordiumban) 10 óra után kialakult új sejtfalak a szögértékeik szerint színeződnek. A színsáv a jobb alsó sarokban látható. A betét a megfelelő 3D-s képet mutatja 0 óránál. A kísérletet kétszer megismételték hasonló eredménnyel. f A dobozdiagramok sejtosztódási arányt jelenítenek meg IPR-ben és nem IPR Col-0 SAM-ban (n = 10 független növény). A középvonal a mediánt, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentiliseket jelzik. A bajusz az R szoftverrel meghatározott minimális és maximális értékeket jelzi. A P értékeket Welch-féle kétirányú t-próbával kaptuk. g, h Sematikus diagram, amely bemutatja (g) az új sejtfal (bíbor) szögének mérését a SAM középpontjától (fehér szaggatott vonal) mért sugárirányhoz képest (csak a hegyesszög értékeket, azaz a 0–90°-ot veszik figyelembe), és (h) a merisztémán belüli kerületi/oldalsó és radiális irányokat. i A sejtosztódási sík orientációjának gyakorisági hisztogramja a SAM (sötétkék), IPR (közepes kék) és nem IPR (világoskék) mentén. A P értékeket kétirányú Kolmogorov-Smirnov teszttel kaptuk. A kísérletet kétszer megismételték hasonló eredménnyel. j Az IPR sejtosztódási síkbeli orientációjának gyakorisági hisztogramja a P3 (világoszöld), P4 (középzöld) és P5 (sötétzöld) körül. A P értékeket kétirányú Kolmogorov-Smirnov teszttel kaptuk. A kísérletet kétszer megismételték hasonló eredménnyel.
Ezért ezt követően a GA jelátvitel és a sejtosztódási aktivitás közötti összefüggést vizsgáltuk az újonnan képződött sejtfalak azonosításával a vizsgálat során (5e. ábra). Ez a megközelítés lehetővé tette a sejtosztódás gyakoriságának és irányának mérését. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a sejtosztódások gyakorisága az IPR-ben és a SAM többi részében (nem IPR, 5f. ábra) hasonló volt, ami azt jelzi, hogy az IPR és a nem IPR sejtek közötti GA jelátvitel különbségei nem befolyásolják szignifikánsan a sejtosztódást. Ez, valamint a GA jelátvitel és a növekedési anizotrópia közötti pozitív korreláció arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, vajon a GA jelátviteli aktivitás befolyásolhatja-e a sejtosztódási sík orientációját. Megmértük az új sejtfal tájolását a merisztéma középpontját és az új sejtfal középpontját összekötő sugártengelyhez viszonyított hegyesszögben (5e-i ábra), és egyértelmű tendenciát figyeltünk meg, hogy a sejtek a sugártengelyhez képest közel 90°-os szögben osztódnak, a legmagasabb frekvenciákat 70-80° és 2302-9% (2382-6%) között figyeltük meg. (5e,i ábra), amely a kerületi/keresztirányú sejtosztódásoknak felel meg (5h. ábra). A GA jelátvitelnek a sejtosztódási viselkedéshez való hozzájárulásának vizsgálatához külön elemeztük az IPR és a nem IPR sejtosztódási paramétereit (5i. ábra). Megfigyeltük, hogy az osztódási szög eloszlása az IPR sejtekben eltért a nem IPR sejtekben vagy a teljes SAM sejtjeitől, ahol az IPR sejtekben nagyobb arányban, azaz 70-80°-ban, illetve 80-90°-ban (33,86%, illetve 30,71%-ban, megfelelő arányban) volt megfigyelhető az oldalsó/körkörös sejtosztódás. Így megfigyeléseink összefüggést mutattak ki a magas GA jelátvitel és a kerületi irányhoz közeli sejtosztódási sík orientáció között, hasonlóan a GA jelátviteli aktivitás és a növekedési anizotrópia közötti összefüggéshez (5c., d. ábra). Ennek az asszociációnak a térbeli megőrzésének további megállapítása érdekében a primordiumot körülvevő IPR sejtekben mértük az osztódási sík orientációját a P3-tól kezdve, mivel a P4-től kezdve ebben a régióban volt a legmagasabb GA jelátviteli aktivitás (4. ábra). Az IPR osztódási szögei P3 és P4 körül nem mutattak statisztikailag szignifikáns különbséget, bár a P4 körüli IPR-ben az oldalsó sejtosztódások megnövekedett gyakorisága volt megfigyelhető (5j. ábra). A P5 körüli IPR-sejtekben azonban a sejtosztódási sík orientációjának különbsége statisztikailag szignifikánssá vált, a transzverzális sejtosztódások gyakoriságának meredek növekedésével (5j. ábra). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a GA jelátvitel szabályozhatja a sejtosztódások orientációját a SAM-ban, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel40, 41 miszerint a magas GA jelátvitel a sejtosztódások oldalirányú orientációját idézheti elő az IPR-ben.
Az előrejelzések szerint az IPR sejtjei nem a primordiákba, hanem inkább az internódiumokba épülnek be2,42,43. A sejtosztódások keresztirányú orientációja az IPR-ben az epidermális sejtek párhuzamos hosszanti sorainak jellegzetes szerveződését eredményezheti az internódiumokban. Fentebb leírt megfigyeléseink arra utalnak, hogy a GA jelátvitel valószínűleg szerepet játszik ebben a folyamatban a sejtosztódás irányának szabályozásával.
Számos DELLA gén funkcióvesztése konstitutív GA választ eredményez, és a della mutánsok felhasználhatók ennek a hipotézisnek a tesztelésére44. Először öt DELLA gén expressziós mintázatát elemeztük a SAM-ban. A GUS vonal transzkripciós fúziója45 feltárta, hogy a GAI, RGA, RGL1 és RGL2 (sokkal kisebb mértékben) expresszálódik a SAM-ban (kiegészítő 11a–d ábra). Az in situ hibridizáció továbbá azt mutatta, hogy a GAI mRNS specifikusan a primordiákban és a fejlődő virágokban halmozódik fel (kiegészítő 11e. ábra). Az RGL1 és RGL3 mRNS-t a SAM lombkoronájában és az idősebb virágokban is kimutatták, míg az RGL2 mRNS a határrégióban volt nagyobb mennyiségben (kiegészítő 11f-h ábra). A pRGL3::RGL3-GFP SAM konfokális képalkotása megerősítette az in situ hibridizációval megfigyelt expressziót, és azt mutatta, hogy az RGL3 fehérje felhalmozódik a SAM központi részében (kiegészítő 11i. ábra). A pRGA::GFP-RGA vonal segítségével azt is megállapítottuk, hogy az RGA fehérje felhalmozódik a SAM-ban, de mennyisége a P4-től kezdve csökken a határon (kiegészítő 11j ábra). Nevezetesen, az RGL3 és RGA expressziós mintázata összhangban van a magasabb GA jelátviteli aktivitással az IPR-ben, amint azt a qmRGA kimutatta (4. ábra). Ezen túlmenően ezek az adatok azt mutatják, hogy az összes DELLA kifejeződik a SAM-ban, és kifejezésük együttesen lefedi a teljes SAM-ot.
Ezt követően elemeztük a sejtosztódási paramétereket a vad típusú SAM (Ler, kontroll) és a gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globális) mutánsokban (6a, b ábra). Érdekes módon statisztikailag szignifikáns eltolódást figyeltünk meg a sejtosztódási szögek gyakoriságának eloszlásában a della global mutáns SAM-ban a vad típushoz képest (6c. ábra). Ez a változás a della globális mutánsban a 80-90°-os szögek (34,71% vs. 24,55%) és kisebb mértékben a 70-80°-os szögek (23,78% vs. 20,18%), azaz a transzverzális sejtosztódásoknak megfelelő gyakoriságának növekedése miatt következett be (6c. ábra). A nem transzverzális osztódások gyakorisága (0-60°) szintén alacsonyabb volt a della global mutánsban (6c. ábra). A transzverzális sejtosztódások gyakorisága szignifikánsan megnövekedett a della global mutáns SAM-jában (6b. ábra). A transzverzális sejtosztódások gyakorisága az IPR-ben szintén magasabb volt a della global mutánsban, mint a vad típusban (6d. ábra). Az IPR régión kívül a vad típusnál egyenletesebb volt a sejtosztódási szögek eloszlása, míg a della global mutáns a tangenciális osztódásokat részesítette előnyben, mint például az IPR (6e. ábra). Számszerűsítettük a sejtosztódások orientációját a ga2 oxidáz (ga2ox) ötszörös mutánsok (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 és ga2ox6-2) SAM-jában, egy GA-inaktív mutáns háttérben, amelyben a GA felhalmozódik. A GA-szintek növekedésével összhangban az ötszörös ga2ox mutáns virágzat SAM-értéke nagyobb volt, mint a Col-0-é (kiegészítő 12a, b ábra), és a Col-0-hoz képest az ötszörös ga2ox SAM a sejtosztódási szögek határozottan eltérő eloszlását mutatta, a szögfrekvencia 5°-ról 50°-ról, azaz ismét 900°-ról osztódásra nőtt. (Kiegészítő 12a–c ábra). Így megmutatjuk, hogy a GA jelátvitel és a GA felhalmozódás konstitutív aktiválása oldalsó sejtosztódást indukál az IPR-ben és a SAM többi részében.
a, b PI-festett Ler (a) és globális della mutáns (b) SAM L1 rétegének 3D vizualizálása konfokális mikroszkóppal. A SAM-ban (de nem a primordiumban) 10 óra alatt kialakult új sejtfalak a szögértékeiknek megfelelően láthatók és színezve. A betéten a SAM látható 0 óránál. A színsáv a jobb alsó sarokban jelenik meg. A (b) pontban lévő nyíl a globális della mutánsban lévő illesztett sejtfájlok példájára mutat. A kísérletet kétszer megismételték hasonló eredménnyel. ce a sejtosztódási sík-orientációk gyakorisági eloszlásának összehasonlítása a teljes SAM-ban (d), IPR-ben (e) és nem-IPR-ben (f) a Ler és a globális della között. A P értékeket kétirányú Kolmogorov-Smirnov teszttel kaptuk. f, g Col-0 (i) és pCUC2::gai-1-VENUS (j) transzgenikus növények PI-festett SAM konfokális képeinek 3D megjelenítése. Az (a, b) panelek a SAM-ban 10 órán belül kialakult új sejtfalakat (de nem primordiumokat) mutatnak. A kísérletet kétszer megismételték hasonló eredménnyel. h–j A teljes SAM-ban (h), IPR (i) és non-IPR (j) elhelyezkedő sejtosztódási sík-orientációk gyakorisági eloszlásának összehasonlítása a Col-0 és a pCUC2::gai-1-VENUS növények között. A P értékeket kétirányú Kolmogorov–Smirnov teszttel kaptuk.
Ezt követően teszteltük a GA jelátvitel gátlásának hatását kifejezetten az IPR-ben. Ebből a célból a cotyledon cup 2 (CUC2) promotert használtuk a VENUS-szal fuzionált domináns negatív gai-1 fehérje expressziójának elősegítésére (a pCUC2::gai-1-VENUS vonalban). A vad típusú SAM-ban a CUC2 promoter a legtöbb IPR expresszióját hajtja a SAM-ban, beleértve a határsejteket is, a P4-től kezdve, és hasonló specifikus expressziót figyeltek meg a pCUC2::gai-1-VENUS növényekben (lásd alább). A sejtosztódási szögek eloszlása a pCUC2::gai-1-VENUS növények SAM-ján vagy IPR-jén nem különbözött szignifikánsan a vad típusú növényekétől, bár váratlanul azt tapasztaltuk, hogy ezekben a növényekben az IPR nélküli sejtek nagyobb, 80–90°-os gyakorisággal osztódnak (6f–j ábra).
Feltételezték, hogy a sejtosztódás iránya a SAM geometriájától függ, különösen a szövet görbülete által generált húzófeszültségtől46. Ezért megkérdeztük, hogy megváltozott-e a SAM alakja a della global mutáns és a pCUC2::gai-1-VENUS növényekben. Amint arról korábban beszámoltunk12, a della globális mutáns SAM mérete nagyobb volt, mint a vad típusé (13a, b, d kiegészítő ábra). A CLV3 és az STM RNS in situ hibridizációja megerősítette a merisztéma expanzióját a della mutánsokban, és tovább mutatta az őssejtrés oldalirányú kiterjedését (13e, f, h, i kiegészítő ábra). A SAM görbülete azonban mindkét genotípusban hasonló volt (13k, m, n, p kiegészítő ábra). Hasonló méretnövekedést figyeltünk meg a gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della négyszeres mutánsban a görbület változása nélkül a vad típushoz képest (13c, d, g, j, l, o, p kiegészítő ábra). A sejtosztódási orientáció gyakorisága a della quadruple mutánsban is érintett volt, de kisebb mértékben, mint a della monolitikus mutánsban (kiegészítő 12d–f ábra). Ez az adagolási hatás, valamint a görbületre gyakorolt hatás hiánya arra utal, hogy a Della négyszeres mutánsban a maradék RGL3 aktivitás korlátozza a sejtosztódási orientációban a DELLA aktivitás elvesztése által okozott változásokat, és hogy az oldalsó sejtosztódások változásai a GA jelátviteli aktivitás változásaira reagálnak, nem pedig a SAM geometriájának változásaira. Amint fentebb leírtuk, a CUC2 promoter a P4-től kezdve irányítja az IPR expressziót a SAM-ban (kiegészítő 14a, b ábra), ezzel szemben a pCUC2::gai-1-VENUS SAM csökkentett méretű, de nagyobb görbületű (kiegészítő 14c-h ábra). Ez a változás a pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfológiájában a mechanikai feszültségek eltérő eloszlását eredményezheti a vad típushoz képest, amelyben a nagy kerületi feszültségek a SAM központjától kisebb távolságban kezdődnek47. Alternatív megoldásként a pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfológiájában bekövetkező változások a regionális mechanikai tulajdonságokban a transzgén expressziója által kiváltott változásokból származhatnak48. Ez mindkét esetben részben ellensúlyozhatja a GA jelátvitelben bekövetkezett változások hatásait azáltal, hogy növeli annak valószínűségét, hogy a sejtek kerületi/keresztirányú orientációban osztódnak, megmagyarázva megfigyeléseinket.
Összességében adataink megerősítik, hogy a magasabb GA jelátvitel aktív szerepet játszik a sejtosztódási sík oldalirányú orientációjában az IPR-ben. Azt is mutatják, hogy a merisztéma görbülete szintén befolyásolja a sejtosztódási sík orientációját az IPR-ben.
Az osztódási sík keresztirányú orientációja az IPR-ben a magas GA jelátviteli aktivitás miatt azt sugallja, hogy a GA előszervez egy radiális sejtfájlt az epidermiszben a SAM-on belül, hogy meghatározza a sejtszerveződést, amely később megtalálható az epidermális internódiumban. Valójában az ilyen sejtfájlok gyakran láthatók voltak a della global mutánsok SAM-képein (6b. ábra). Így a GA jelátvitel térbeli mintázatának fejlődési funkciójának további feltárása érdekében a SAM-ban időzített képalkotást alkalmaztunk az IPR-ben lévő sejtek térbeli szerveződésének elemzésére vad típusú (Ler és Col-0), della globális mutánsokban és pCUC2::gai-1-VENUS transzgenikus növényekben.
Azt találtuk, hogy a qmRGA kimutatta, hogy a GA jelátviteli aktivitás az IPR-ben a P1/P2-ről nőtt, és a P4-nél érte el a csúcsot, és ez a mintázat az idő múlásával állandó maradt (4a–f ábra és kiegészítő 8c–f, k ábra). A növekvő GA jelű IPR-ben lévő sejtek térbeli szerveződésének elemzéséhez a P4 felett és oldalán lévő Ler IPR sejteket 34 órával az első megfigyelés után elemeztük fejlődési sorsuk szerint, azaz több mint két plasztisz alkalommal, lehetővé téve az IPR sejtek követését a primordium fejlődése során P1/P2-től P4-ig. Három különböző színt használtunk: sárgát azokhoz a sejtekhez, amelyek a P4 közelében integrálódtak a primordiumba, zöldet az IPR-ben lévőkhöz, és lilát azoknak, amelyek mindkét folyamatban részt vettek (7a–c. ábra). t0-nál (0 óra) 1-2 réteg IPR sejt volt látható a P4 előtt (7a. ábra). Ahogy az várható volt, amikor ezek a sejtek osztódtak, azt főleg a keresztirányú osztódási síkon keresztül tették (7a–c. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk a Col-0 SAM-mal (a P3-ra fókuszálva, amelynek határredői a P4-hez hasonlóan Lerben), bár ebben a genotípusban a virághatáron kialakult redő gyorsabban elrejtette az IPR sejteket (7g–i. ábra). Így az IPR sejtek osztódási mintája előszervezi a sejteket radiális sorokba, mint az internódiumokban. A radiális sorok szerveződése és az egymást követő szervek közötti IPR-sejtek lokalizációja arra utal, hogy ezek a sejtek internodális progenitorok.
Itt kifejlesztettünk egy ratiometrikus GA jelátviteli bioszenzort, a qmRGA-t, amely lehetővé teszi a kombinált GA és GA receptor koncentrációk eredményeként létrejövő GA jelátviteli aktivitás kvantitatív feltérképezését, miközben minimalizálja az endogén jelátviteli útvonalakkal való interferenciát, ezáltal információt szolgáltat a GA működéséről sejtszinten. Ebből a célból létrehoztunk egy módosított DELLA fehérjét, az mRGA-t, amely elvesztette a DELLA interakciós partnerekhez való kötődési képességét, de továbbra is érzékeny a GA-indukált proteolízisre. A qmRGA mind a GA-szintek exogén, mind endogén változásaira reagál, és dinamikus érzékelési tulajdonságai lehetővé teszik a GA jelátviteli aktivitás térbeli és időbeli változásainak értékelését a fejlődés során. A qmRGA emellett nagyon rugalmas eszköz, mivel az expressziójához használt promoter megváltoztatásával (ha szükséges) adaptálható a különböző szövetekhez, és tekintettel a GA jelátviteli útvonal és a PFYRE motívum konzervált jellegére a zárvatermők között, valószínűleg átvihető más fajokra22. Ezzel összhangban a rizs SLR1 DELLA fehérjében (HYY497AAA) egy ekvivalens mutációról kimutatták, hogy elnyomja az SLR1 növekedési represszor aktivitását, miközben az mRGA23-hoz hasonlóan csak kismértékben csökkenti a GA által közvetített lebomlását. Nevezetesen, az Arabidopsis-szal végzett legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a PFYRE doménben (S474L) egyetlen aminosavmutáció megváltoztatta az RGA transzkripciós aktivitását anélkül, hogy befolyásolta volna a transzkripciós faktor partnerekkel való kölcsönhatási képességét50. Bár ez a mutáció nagyon közel áll az mRGA-ban jelenlévő 3 aminosav szubsztitúcióhoz, vizsgálataink azt mutatják, hogy ez a két mutáció megváltoztatja a DELLA különböző jellemzőit. Bár a legtöbb transzkripciós faktor partner kötődik a DELLA26,51 LHR1 és SAW doménjéhez, a PFYRE domén egyes konzervált aminosavai segíthetnek stabilizálni ezeket a kölcsönhatásokat.
A csomóközi fejlődés kulcsfontosságú jellemzője a növényi architektúrának és a termésnövelésnek. A qmRGA magasabb GA jelátviteli aktivitást mutatott ki IPR internode progenitor sejtekben. A kvantitatív képalkotás és a genetika kombinálásával megmutattuk, hogy a GA jelátviteli minták egymásra helyezik a körkörös/transzverzális sejtosztódási síkokat a SAM epidermiszben, kialakítva a csomóközi fejlődéshez szükséges sejtosztódási szerveződést. A fejlesztés során számos sejtosztódási sík-orientáció szabályozóját azonosították52,53. Munkánk világos példát ad arra, hogy a GA jelátviteli tevékenység hogyan szabályozza ezt a celluláris paramétert. A DELLA kölcsönhatásba léphet a prefolding fehérjekomplexekkel41, így a GA jelátvitel szabályozhatja a sejtosztódási sík orientációját azáltal, hogy közvetlenül befolyásolja a kérgi mikrotubulusok orientációját40,41,54,55. Váratlanul kimutattuk, hogy a SAM-ban a magasabb GA jelátviteli aktivitás korrelációja nem a sejt megnyúlása vagy osztódása, hanem csak a növekedési anizotrópia, ami összhangban van a GA közvetlen hatásával a sejtosztódás irányára az IPR-ben. Nem zárhatjuk ki azonban, hogy ez a hatás közvetett is lehet, például a GA által kiváltott sejtfallágyulás közvetítésével56. A sejtfal tulajdonságaiban bekövetkező változások mechanikai igénybevételt idéznek elő57,58, ami a sejtosztódási sík orientációját is befolyásolhatja azáltal, hogy befolyásolja a kérgi mikrotubulusok orientációját39,46,59. A GA által kiváltott mechanikai igénybevétel és a mikrotubulusok orientációjának GA általi közvetlen szabályozása együttes hatásai szerepet játszhatnak az IPR sejtosztódási orientációjának specifikus mintázatában az internódiumok meghatározásához, és további vizsgálatokra van szükség ennek az ötletnek a teszteléséhez. Hasonlóképpen, korábbi tanulmányok is rávilágítottak a DELLA-val kölcsönhatásba lépő TCP14 és 15 fehérjék fontosságára a csomópontok kialakulásának szabályozásában60,61, és ezek a tényezők közvetíthetik a GA hatását a BREVIPEDICELLUS (BP) és PENNYWISE (PNY) mellett, amelyek szabályozzák a csomópontok fejlődését, és kimutatták, hogy befolyásolják a GA jelátvitelt2,62. Tekintettel arra, hogy a DELLA-k kölcsönhatásba lépnek a brassinoszteroid, etilén, jázmonsav és abszcizinsav (ABA) jelátviteli útvonalakkal63,64, és ezek a hormonok befolyásolhatják a mikrotubulusok orientációját65, a GA sejtosztódási orientációra gyakorolt hatásait más hormonok is közvetíthetik.
A korai citológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az Arabidopsis SAM belső és külső régiói egyaránt szükségesek az internódiumok fejlődéséhez2,42. Az a tény, hogy a GA aktívan szabályozza a sejtosztódást a belső szövetekben12, alátámasztja a GA kettős funkcióját a merisztéma és a csomóközi méret szabályozásában a SAM-ban. Az irányított sejtosztódás mintázata a belső SAM-szövetben is szigorúan szabályozott, és ez a szabályozás elengedhetetlen a szárnövekedéshez52. Érdekes lesz megvizsgálni, hogy a GA szerepet játszik-e a sejtosztódási sík orientálásában a belső SAM szervezetben, ezáltal szinkronizálva a SAM-en belüli internode-ok specifikációját és fejlesztését.
A növényeket in vitro talajban vagy 1% szacharózzal és 1% agarral (Sigma) kiegészített 1x Murashige-Skoog (MS) táptalajban (Duchefa) nevelték normál körülmények között (16 óra fény, 22 °C), kivéve a hipokotil- és gyökérnövekedési kísérleteket, amelyekben a palántákat függőleges lemezeken, állandó fényben és 22 °C-on nevelték. A nitrátkísérletekhez a növényeket megfelelő nitráttal (0 vagy 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-szukcináttal, 1% szacharózzal és 1% A-agarral (Sigma) kiegészített módosított MS táptalajon (bioWORLD növényi táptalaj) neveltük hosszú napos körülmények között.
A pDONR221-be inszertált GID1a cDNS-t pDONR P4-P1R-pUBQ10 és pDONR P2R-P3-mCherry pB7m34GW-be rekombináltuk a pUBQ10::GID1a-mCherry létrehozása céljából. A pDONR221-be inszertált IDD2 DNS-t pB7RWG266-ba rekombináltuk a p35S:IDD2-RFP előállításához. A pGID1b::2xmTQ2-GID1b előállításához a GID1b kódoló régiótól 3,9 kb-os fragmentumot, valamint a GID1b cDNS-t (1,3 kb) és terminátort (3,4 kb) tartalmazó 4,7 kb-os fragmentumot először amplifikáltuk a 3. kiegészítő táblázat primereivel, majd a PDONRific-t S-P1R-be illesztettük be. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), és végül a pDONR221 2xmTQ268-cal rekombináltuk a pGreen 012567 célvektorba Gateway klónozással. A pCUC2::LSSmOrange generálásához a CUC2 promoter szekvenciát (3229 bp az ATG-től felfelé), majd a nagy Stokes-eltolódott mOrange (LSSmOrange)69 kódoló szekvenciáját az N7 nukleáris lokalizációs szignállal és a NOS transzkripciós terminátorral összeállítottuk a pGreen kanamicin fólia célzórendszer-recom3 vektor segítségével. (Invitrogen). A növényi bináris vektort az Agrobacterium tumefaciens GV3101 törzsbe, a Nicotiana benthamiana levelekbe Agrobacterium infiltrációs módszerrel, illetve az Arabidopsis thaliana Col-0 törzsbe virágos dip módszerrel juttattuk be. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry és pCLV3::mCherry-NLS qmRGA-t izoláltunk a megfelelő keresztezések F3 és F1 utódjaiból.
Az RNS in situ hibridizációját körülbelül 1 cm hosszú hajtásvégeken72 végeztük, amelyeket összegyűjtöttünk és azonnal fixáltunk 4 °C-ra előhűtött FAA oldatban (3,7% formaldehid, 5% ecetsav, 50% etanol). 2 × 15 perces vákuumkezelés után a fixálót kicseréltük, és a mintákat egy éjszakán át inkubáltuk. A GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 és RGL3 cDNS-eket és a 3'-UTR-jukhoz tartozó antiszensz próbákat a 3. kiegészítő táblázatban bemutatott primerek felhasználásával szintetizáltuk Rosier és mtsai.73 szerint. A digoxigeninnel jelölt próbák immundetektálása digoxigenin antitestekkel történt (3000-szeres hígítás; Roche, katalógusszám: 11 093 274 910), és a metszeteket 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfáttal (BCIP) tetraniliumtrozolu-25-szeres festéssel festettük. (NBT, 200-szoros hígítású) oldat.
Feladás időpontja: 2025.02.10