Ebben a vizsgálatban a kombinált kezelés stimuláló hatásait vizsgálták.növényi növekedésszabályozókVizsgálták a (2,4-D és kinetin) és a vas-oxid nanorészecskék (Fe₃O₄-NP-k) in vitro morfogenezisre és másodlagos metabolit termelésre gyakorolt hatását a *Hypericum perforatum* L.-ben. Az optimalizált kezelés [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetin (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP-k (4 mg/l)] jelentősen javította a növény növekedési paramétereit: a növény magassága 59,6%-kal, a gyökérhossz 114,0%-kal, a rügyszám 180,0%-kal, a kallusz friss tömege pedig 198,3%-kal nőtt a kontrollcsoporthoz képest. Ez a kombinált kezelés a regeneráció hatékonyságát is növelte (50,85%), és a hipericin-tartalmat 66,6%-kal növelte. A GC-MS analízis magas hiperozid-, β-patolén- és cetil-alkohol-tartalmat mutatott ki, ami a teljes csúcsterület 93,36%-át teszi ki, míg a teljes fenolos és flavonoidos tartalom akár 80,1%-kal is nőtt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a növényi növekedésszabályozók (PGR-ek) és a Fe₃O₄ nanorészecskék (Fe₃O₄-NP-k) szinergikus hatást fejtenek ki az organogenezis és a bioaktív vegyületek felhalmozódásának serkentésével, ami ígéretes stratégiát jelent a gyógynövények biotechnológiai fejlesztésére.
Az orbáncfű (Hypericum perforatum L.), más néven orbáncfű, a Hypericaceae családba tartozó évelő lágyszárú növény, amely gazdasági értékkel bír.[1] Potenciális bioaktív összetevői közé tartoznak a természetes tanninok, xantonok, floroglucinol, naftalin-diantron (hiperin és pszeudohiperin), flavonoidok, fenolos savak és illóolajok.[2,3,4] Az orbáncfű hagyományos módszerekkel szaporítható; azonban a hagyományos módszerek szezonalitása, az alacsony magvak csírázási képessége és a betegségekre való hajlam korlátozza a nagymértékű termesztésre és a másodlagos metabolitok folyamatos képződésére való alkalmasságát.[1,5,6]
Így az in vitro szövettenyészet hatékony módszernek tekinthető a növények gyors szaporítására, a csíraplazma-erőforrások megőrzésére és a gyógyászati vegyületek hozamának növelésére [7, 8]. A növényi növekedésszabályozók (PGR-ek) kulcsszerepet játszanak a morfogenezis szabályozásában, és szükségesek a kallusz és az egész organizmusok in vitro tenyésztéséhez. Koncentrációik és kombinációik optimalizálása kulcsfontosságú ezen fejlődési folyamatok sikeres befejezéséhez [9]. Ezért a szabályozók megfelelő összetételének és koncentrációjának megértése fontos az orbáncfű (H. perforatum) növekedésének és regenerációs képességének javítása érdekében [10].
A vas-oxid nanorészecskék (Fe₃O₄) egy olyan nanorészecskék, amelyeket szövettenyésztésre fejlesztettek vagy fejlesztenek. A Fe₃O₂ jelentős mágneses tulajdonságokkal, jó biokompatibilitással, valamint a növények növekedését elősegítő és a környezeti stresszt csökkentő képességgel rendelkezik, így jelentős figyelmet kapott a szövettenyészet-tervezésben. Ezen nanorészecskék lehetséges alkalmazásai közé tartozhat az in vitro kultúra optimalizálása a sejtosztódás elősegítése, a tápanyagfelvétel javítása és az antioxidáns enzimek aktiválása érdekében [11].
Bár a nanorészecskék jó növénynövekedést elősegítő hatást mutattak, a Fe₃O₄ nanorészecskék és az optimalizált növényi növekedésszabályozók kombinált alkalmazásáról a *H. perforatum* esetében kevés tanulmány készült. Ennek a tudásbeli hiányosságnak a pótlása érdekében ez a tanulmány értékelte ezek kombinált hatásának hatását az in vitro morfogenezisre és a másodlagos metabolitok termelésére, hogy új ismereteket nyújtson a gyógynövények tulajdonságainak javításához. Ezért a tanulmánynak két célja van: (1) a növényi növekedésszabályozók koncentrációjának optimalizálása a kalluszképződés, a hajtásregeneráció és a gyökeresedés hatékony elősegítése érdekében in vitro; és (2) a Fe₃O₄ nanorészecskék hatásának értékelése a növekedési paraméterekre in vitro. A jövőbeli tervek között szerepel a regenerált növények túlélési arányának értékelése az akklimatizáció során (in vitro). A vizsgálat eredményei várhatóan jelentősen javítják a *H. perforatum* mikroszaporítási hatékonyságát, hozzájárulva ezáltal e fontos gyógynövény fenntartható használatához és biotechnológiai alkalmazásaihoz.
Ebben a tanulmányban szabadföldön termesztett egynyári orbáncfű növényekből (anyanövényekből) nyertünk levélkivonatokat. Ezeket az explantátumokat használtuk az in vitro tenyésztési körülmények optimalizálására. Tenyésztés előtt a leveleket alaposan leöblítettük folyó desztillált víz alatt néhány percig. Az explantátumok felületét ezután 30 másodpercig 70%-os etanolba mártottuk, majd 10 percig néhány csepp Tween 20-at tartalmazó 1,5%-os nátrium-hipoklorit (NaOCl) oldatba mártottuk. Végül az explantátumokat háromszor leöblítettük steril desztillált vízzel, mielőtt átvittük volna őket a következő táptalajba.
A következő négy hétben mérték a hajtásregenerációs paramétereket, beleértve a regenerációs sebességet, az explantátumonkénti hajtásszámot és a hajtáshosszt. Amikor a regenerálódott hajtások elérték a legalább 2 cm hosszúságot, azokat gyökereztető közegbe helyezték, amely félkoncentrációjú MS közegből, 0,5 mg/L indolvajsavból (IBA) és 0,3% guargumiból állt. A gyökereztető tenyésztést három hétig folytatták, ezalatt mérték a gyökeresedési sebességet, a gyökérszámot és a gyökérhosszt. Minden kezelést háromszor megismételtek, ismétlésenként 10 explantátumot tenyésztve, így kezelésenként körülbelül 30 explantátumot kaptak.
A növények magasságát centiméterben (cm) mérték vonalzó segítségével, a növény tövétől a legmagasabb levél csúcsáig. A gyökérhosszt milliméterben (mm) mérték közvetlenül a palánták óvatos eltávolítása és a termesztőközeg eltávolítása után. A rügyek számát explantátumonként közvetlenül minden növényen megszámolták. A leveleken található fekete foltok, az úgynevezett göbök számát vizuálisan mérték. Úgy vélik, hogy ezek a fekete göbök hipericint tartalmazó mirigyek, vagyis oxidatív foltok, és a növény kezelésre adott válaszának fiziológiai indikátoraként szolgálnak. A termesztőközeg teljes eltávolítása után a palánták friss tömegét milligramm (mg) pontosságú elektronikus mérleggel mérték.
A kalluszképződés sebességének kiszámítására szolgáló módszer a következő: miután az explantátumokat négy hétig különféle növekedésszabályozókat (kinázok, 2,4-D és Fe3O4) tartalmazó táptalajon tenyésztjük, megszámoljuk a kalluszképzésre képes explantátumok számát. A kalluszképződés sebességének kiszámítására szolgáló képlet a következő:
Minden kezelést háromszor ismételtünk meg, ismétlésenként legalább 10 explantátumot vizsgálva.
A regenerációs ráta a kalluszszövet azon arányát tükrözi, amely sikeresen befejezi a rügydifferenciálódási folyamatot a kalluszképződési szakasz után. Ez a mutató a kalluszszövet azon képességét mutatja, hogy differenciálódott szövetté alakuljon át és új növényi szervekké fejlődjön.
A gyökeresedési együttható a gyökeresedésre képes ágak számának és az összes ág számának aránya. Ez a mutató a gyökeresedési szakasz sikerességét tükrözi, ami kulcsfontosságú a mikroszaporítás és a növényszaporítás során, mivel a jó gyökeresedés segíti a palántákat a növekedési körülmények jobb túlélésében.
A hipericin vegyületeket 90%-os metanollal extraháltuk. Ötven mg szárított növényi anyagot adtunk 1 ml metanolhoz, és 20 percig 30 kHz-en ultrahanggal kezeltük ultrahangos tisztítóban (A5120-3YJ modell) szobahőmérsékleten, sötétben. Az ultrahangos kezelés után a mintát 6000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, és a hipericin abszorbanciáját 592 nm-en mértük Plus-3000 S spektrofotométerrel, Conceiçao és munkatársai által leírt módszer szerint [14].
A növényi növekedésszabályozókkal (PGR) és vas-oxid nanorészecskékkel (Fe₃O₄-NP) végzett legtöbb kezelés nem indukált fekete göbök képződését a regenerálódott hajtásleveleken. A 0,5 vagy 1 mg/l 2,4-D, 0,5 vagy 1 mg/l kinetin, illetve az 1, 2 vagy 4 mg/l vas-oxid nanorészecskékkel végzett kezelések egyikében sem figyeltek meg göböket. Néhány kombináció enyhe növekedést mutatott a göbök fejlődésében (de statisztikailag nem szignifikánsan) a kinetin és/vagy vas-oxid nanorészecskék magasabb koncentrációinál, például a 2,4-D (0,5–2 mg/l) kinetinnel (1–1,5 mg/l) és vas-oxid nanorészecskékkel (2–4 mg/l) kombinálva. Ezeket az eredményeket a 2. ábra mutatja. A fekete göbök hipericinben gazdag mirigyeket jelentenek, amelyek mind természetesen előfordulnak, mind hasznosak. Ebben a vizsgálatban a fekete göbök főként a szövetek barnulásával jártak együtt, ami a hipericin felhalmozódásának kedvező környezetét jelzi. A 2,4-D, kinetin és Fe₃O₄ nanorészecskékkel végzett kezelés elősegítette a kallusz növekedését, csökkentette a barnulást és növelte a klorofilltartalmat, ami a javuló anyagcsere-funkcióra és az oxidatív károsodás potenciális csökkenésére utal [37]. Ez a tanulmány a kinetin 2,4-D és Fe₃O₄ nanorészecskékkel kombinált hatását értékelte az orbáncfű kalluszának növekedésére és fejlődésére (3a–g. ábra). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Fe₃O₄ nanorészecskék gombaellenes és antimikrobiális aktivitással rendelkeznek [38, 39], és növényi növekedésszabályozókkal kombinálva stimulálhatják a növények védekező mechanizmusait és csökkenthetik a sejtek stresszindexeit [18]. Bár a másodlagos metabolitok bioszintézise genetikailag szabályozott, tényleges hozamuk nagymértékben függ a környezeti feltételektől. A metabolikus és morfológiai változások befolyásolhatják a másodlagos metabolitok szintjét azáltal, hogy szabályozzák a specifikus növényi gének expresszióját és reagálnak a környezeti tényezőkre. Továbbá az induktorok új gének aktiválódását válthatják ki, amelyek viszont stimulálják az enzimatikus aktivitást, végső soron több bioszintetikus útvonalat aktiválva és másodlagos metabolitok képződéséhez vezetve. Továbbá egy másik tanulmány kimutatta, hogy az árnyékolás csökkentése növeli a napfénynek való kitettséget, ezáltal megemeli a nappali hőmérsékletet a *Hypericum perforatum* természetes élőhelyén, ami szintén hozzájárul a hipericin hozam növekedéséhez. Ezen adatok alapján ez a tanulmány a vas nanorészecskék potenciális induktorként betöltött szerepét vizsgálta a szövettenyészetben. Az eredmények azt mutatták, hogy ezek a nanorészecskék enzimatikus stimuláció révén aktiválhatják a heszperidin bioszintézisében részt vevő géneket, ami a vegyület fokozott felhalmozódásához vezet (2. ábra). Ezért a természetes körülmények között növekvő növényekkel összehasonlítva azzal érvelhetünk, hogy az ilyen vegyületek in vivo termelése akkor is fokozható, ha a mérsékelt stresszt a másodlagos metabolitok bioszintézisében részt vevő gének aktiválásával kombinálják. A kombinált kezelések általában pozitív hatással vannak a regenerációs sebességre, de bizonyos esetekben ez a hatás gyengül. Figyelemre méltó, hogy az 1 mg/L 2,4-D-vel, 1,5 mg/L kinázzal és különböző koncentrációkkal végzett kezelés egymástól függetlenül és szignifikánsan, 50,85%-kal növelheti a regenerációs sebességet a kontrollcsoporthoz képest (4c. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a nanohormonok specifikus kombinációi szinergikusan hathatnak a növények növekedésének és az anyagcsere-termelésnek az elősegítésében, ami nagy jelentőséggel bír a gyógynövények szövettenyésztése szempontjából. Palmer és Keller [50] kimutatták, hogy a 2,4-D kezelés önállóan is képes kalluszképződést indukálni a St. perforatumban, míg a kináz hozzáadása jelentősen fokozta a kalluszképződést és a regenerációt. Ez a hatás a hormonális egyensúly javulásának és a sejtosztódás stimulálásának volt köszönhető. Bal és munkatársai [51] kimutatták, hogy a Fe₃O₄-NP kezelés önállóan is fokozhatja az antioxidáns enzimek működését, ezáltal elősegítve a gyökérnövekedést a St. perforatumban. A 0,5 mg/l, 1 mg/l és 1,5 mg/l koncentrációban Fe₃O₄ nanorészecskéket tartalmazó táptalajok javították a len növények regenerációs sebességét [52]. A kinetin, a 2,4-diklór-benzotiazolinon és a Fe₃O₄ nanorészecskék használata jelentősen javította a kallusz- és gyökérképződés sebességét, azonban figyelembe kell venni ezen hormonok in vitro regenerációra való alkalmazásának lehetséges mellékhatásait. Például a 2,4-diklór-benzotiazolinon vagy kinetin hosszú távú vagy nagy koncentrációjú használata szomatikus klonális variációt, oxidatív stresszt, rendellenes kalluszmorfológiát vagy üvegesedést eredményezhet. Ezért a magas regenerációs ráta nem feltétlenül jósolja meg a genetikai stabilitást. Minden regenerált növényt molekuláris markerekkel (pl. RAPD, ISSR, AFLP) vagy citogenetikai elemzéssel kell értékelni, hogy meghatározzuk homogenitásukat és az in vivo növényekkel való hasonlóságukat [53,54,55].
Ez a tanulmány elsőként bizonyította, hogy a növényi növekedésszabályozók (2,4-D és kinetin) Fe₃O₄ nanorészecskékkel kombinált alkalmazása fokozhatja a morfogenezist és a kulcsfontosságú bioaktív metabolitok (beleértve a hipericint és a hiperozidot) felhalmozódását a *Hypericum perforatum*-ban. Az optimalizált kezelési rend (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetin + 4 mg/l Fe₃O₄-NP-k) nemcsak maximalizálta a kalluszképződést, az organogenezist és a másodlagos metabolitok hozamát, hanem enyhe indukáló hatást is mutatott, potenciálisan javítva a növény stressztűrő képességét és gyógyászati értékét. A nanotechnológia és a növényi szövettenyészet kombinációja fenntartható és hatékony platformot biztosít a gyógyászati vegyületek nagymértékű in vitro előállításához. Ezek az eredmények utat nyitnak az ipari alkalmazások és a molekuláris mechanizmusok, az adagolás optimalizálása és a genetikai pontosság jövőbeli kutatásai előtt, ezáltal összekapcsolva a gyógynövényekkel kapcsolatos alapkutatást a gyakorlati biotechnológiával.
Közzététel ideje: 2025. dec. 12.