Az N,N-dietil-m-toluamid féreghajtó gyógyszer (DEET) gátolja az AChE-t (acetilkolinészteráz), és a túlzott vaszkularizáció miatt potenciálisan rákkeltő tulajdonságokkal rendelkezik. Ebben a cikkben bemutatjuk, hogy a DEET specifikusan stimulálja az angiogenezist elősegítő endotélsejteket, ezáltal fokozva a tumor növekedését. A DEET aktiválja az angiogenezishez vezető sejtfolyamatokat, beleértve a proliferációt, a migrációt és az adhéziót. Ez összefüggésben áll a fokozott NO-termeléssel és a VEGF-expresszióval az endotélsejtekben. Az M3 elnémítása vagy farmakológiai M3-gátlók alkalmazása megszüntette ezeket a hatásokat, ami arra utal, hogy a DEET által indukált angiogenezis M3-érzékeny. Az M3-receptorokat túlexpresszáló endotél- és HEK-sejtekben a kalciumjelátvitelt magában foglaló kísérletek, valamint a kötődési és dokkolási vizsgálatok azt mutatják, hogy a DEET az M3-receptorok allosztérikus modulátoraként működik. Továbbá a DEET gátolja az AChE-t, ezáltal növeli az acetilkolin biohasznosulását és az M3-receptorokhoz való kötődését, és az allosztérikus szabályozáson keresztül fokozza a proangiogén hatásokat.
Az elsődleges endotélsejteket svájci egerek aortájából izoláltuk. Az extrakciós módszert a Kobayashi protokollból26 adaptáltuk. Az egér endotélsejteket 5% hővel inaktivált FBS-sel kiegészített EBM-2 táptalajon tenyésztettük a negyedik passzázsig.
A DEET két koncentrációjának a HUVEC, U87MG vagy BF16F10 proliferációjára gyakorolt hatását a CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) segítségével elemeztük. Röviden, lyukanként 5,103 sejtet helyeztünk egy 96 lyukú lemezre, hagytuk, hogy a sejtek egy éjszakán át tapadjanak, majd 24 órán át DEET-tel kezeltük. A növekedési táptalaj eltávolítása után festékkötő oldatot adtunk a mikrotiterlemez minden egyes lyukához, és a sejteket 37 °C-on inkubáltuk 30 percig. A fluoreszcencia szinteket Mithras LB940 multimódusú mikrotiterlemez-leolvasóval (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Németország) határoztuk meg, amely 485 nm-es gerjesztő szűrőkkel és 530 nm-es emissziós szűrőkkel volt felszerelve.
A HUVEC sejteket 96-lyukú lemezekre oltották 104 sejt/lyuk sűrűséggel. A sejteket 24 órán át DEET-tel kezelték. A sejtek életképességét kolorimetriás MTT assay-vel (Sigma-Aldrich, M5655) értékelték. Az optikai sűrűség értékeket multimódusú mikroplate-leolvasón (Mithras LB940) mérték 570 nm hullámhosszon.
A DEET hatásait in vitro angiogenezis vizsgálatokkal vizsgálták. A 10-8 M vagy 10-5 M DEET-tel történő kezelés fokozta a kapilláris hossz kialakulását a HUVEC-ekben (1a., b. ábra, fehér oszlopok). A kontrollcsoporthoz képest a 10-14 és 10-5 M közötti DEET-koncentrációkkal végzett kezelés azt mutatta, hogy a kapilláris hossz 10-8 M DEET-nél elérte a platót (S2. kiegészítő ábra). A 10-8 M és 10-5 M koncentrációtartományban DEET-tel kezelt HUVEC-ek in vitro proangiogén hatásában nem találtak szignifikáns különbséget.
A DEET neovaszkularizációra gyakorolt hatásának meghatározása érdekében in vivo neovaszkularizációs vizsgálatokat végeztünk. 14 nap elteltével a 10-8 M vagy 10-5 M DEET-tel előtenyésztett endotélsejtekkel injektált egerek hemoglobin-tartalmának jelentős növekedését mutatták (1c. ábra, fehér oszlopok).
Továbbá a DEET által kiváltott neovaszkularizációt U87MG xenograftot hordozó egerekben vizsgálták, amelyeket naponta (ip) injektáltak DEET-tel, olyan dózisban, amelyről ismert, hogy 10-5 M plazmakoncentrációt indukál, ami normális az expozíciónak kitett embereknél. 23 napon. Kimutatható tumorokat (azaz 100 mm3-nél nagyobb tumorokat) figyeltek meg 14 nappal az U87MG sejtek egerekbe történő injekciózása után. A 28. napon a tumor növekedése szignifikánsan fokozódott a DEET-tel kezelt egerekben a kontroll egerekhez képest (1d. ábra, négyzetek). Továbbá a tumorok CD31 festése azt mutatta, hogy a DEET szignifikánsan növelte a kapilláris területét, de nem a mikroér sűrűségét. (1e–g. ábra).
A muszkarinreceptorok DETA-indukálta proliferációban betöltött szerepének meghatározásához 10-8 M vagy 10-5 M DETA-t alkalmaztunk pFHHSiD (10-7 M, egy szelektív M3 receptor antagonista) jelenlétében. HUVEC kezelése. A pFHHSiD minden koncentrációban teljesen blokkolta a DETA proliferatív tulajdonságait (1. táblázat).
Ilyen körülmények között azt is megvizsgáltuk, hogy a DEET növeli-e a kapillárisok hosszát a HUVEC sejtekben. Hasonlóképpen, a pFHHSiD jelentősen megakadályozta a DEET által kiváltott kapilláris hossz növekedését (1a., b. ábra, szürke oszlopok). Továbbá hasonló kísérleteket végeztünk M3 siRNS-sel. Bár a kontroll siRNS nem volt hatékony a kapilláris képződés elősegítésében, az M3 muszkarin receptor elnémítása megszüntette a DEET kapilláris hosszának növelésére való képességét (1a., b. ábra, fekete oszlopok).
Továbbá a pFHHSiD teljesen blokkolta mind a 10-8 M vagy 10-5 M DEET által in vitro kiváltott vaszkularizációt, mind az in vivo neovaszkularizációt (1c., d. ábra, körök). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a DEET egy szelektív M3 receptor antagonistákra vagy M3 siRNS-re érzékeny útvonalon keresztül elősegíti az angiogenezist.
Az AChE a DEET molekuláris célpontja. Az olyan gyógyszerek, mint a donepezil, amelyek AChE-gátlóként hatnak, in vitro és egér hátsó végtagi ischaemia modellekben stimulálhatják az endothel angiogenezist. Két DEET-koncentrációnak az AChE enzim aktivitására gyakorolt hatását teszteltük HUVEC-ben. Az alacsony (10-8 M) és a magas (10-5 M) DEET-koncentrációk csökkentették az endothel AChE aktivitását a kontroll körülményekhez képest (2. ábra).
A DEET mindkét koncentrációja (10-8 M és 10-5 M) csökkentette az acetilkolinészteráz aktivitását a HUVEC-en. A BW284c51-et (10-5 M) használták kontrollként az acetilkolinészteráz inhibitorokhoz. Az eredményeket az AChE aktivitás százalékában fejezzük ki a két DEET-koncentrációval kezelt HUVEC-en a vivőanyaggal kezelt sejtekhez viszonyítva. Az értékeket hat független kísérlet átlaga ± SEM-ként fejezzük ki. *p < 0,05 a kontrollhoz képest (Kruskal-Wallis és Dunn többszörös összehasonlító teszt).
A nitrogén-monoxid (NO) részt vesz az angiogén folyamatban,33 ezért vizsgálták a DEET-stimulált HUVEC-ekben a NO-termelést. A DEET-tel kezelt endoteliális NO-termelés megnövekedett a kontrollsejtekhez képest, de csak 10-8 M dózisban érte el a szignifikáns hatást (3c. ábra). A DEET által indukált NO-termelést szabályozó molekuláris változások meghatározásához az eNOS expresszióját és aktivációját Western blot analízissel elemezték. Bár a DEET-kezelés nem változtatta meg az eNOS expresszióját, szignifikánsan növelte az eNOS foszforilációját az aktiváló helyén (Ser-1177), miközben csökkentette a gátlóhelyét (Thr-495) a kezeletlen sejtekhez képest az eNOS foszforilációjában (3d. ábra). Továbbá a foszforilált eNOS arányát az aktivációs helyen és a gátlóhelyen a foszforilált eNOS mennyiségének az enzim teljes mennyiségéhez való normalizálása után számították ki. Ez az arány szignifikánsan nőtt a DEET minden koncentrációjával kezelt HUVEC-ekben a kezeletlen sejtekhez képest (3d. ábra).
Végül a VEGF, az egyik fő proangiogén faktor expresszióját Western blot analízissel elemeztük. A DEET szignifikánsan növelte a VEGF expresszióját, míg a pFHHSiD teljesen blokkolta azt.
Mivel a DEET hatásai érzékenyek mind az M3 receptorok farmakológiai blokkolására, mind a szabályozásának csökkentésére, teszteltük azt a hipotézist, hogy a DEET fokozhatja a kalciumjelátvitelt. Meglepő módon a DEET egyik alkalmazott koncentráció esetében sem növelte a citoplazmatikus kalciumszintet a HUVEC-ben (adatok nem láthatók) és a HEK/M3-ban (4a., b. ábra).
Közzététel ideje: 2024. dec. 30.