Az N,N-dietil-m-toluamid féreghajtó gyógyszer (DEET) arról számoltak be, hogy gátolja az AChE-t (acetilkolinészteráz), és a túlzott vaszkularizáció miatt potenciálisan rákkeltő tulajdonságokkal rendelkezik. Ebben a cikkben bemutatjuk, hogy a DEET specifikusan stimulálja az angiogenezist elősegítő endothel sejteket, ezáltal fokozza a daganat növekedését. A DEET aktiválja az angiogenezishez vezető sejtfolyamatokat, beleértve a proliferációt, migrációt és adhéziót. Ez az endothel sejtekben fokozott NO-termeléssel és VEGF-expresszióval jár. Az M3 elnémítása vagy farmakológiai M3-inhibitorok alkalmazása megszüntette ezeket a hatásokat, ami arra utal, hogy a DEET-indukált angiogenezis M3-érzékeny. Az M3-receptorokat túlzottan expresszáló endothel- és HEK-sejtek kalcium-jelátvitelével kapcsolatos kísérletek, valamint a kötődési és dokkolási vizsgálatok azt mutatják, hogy a DEET az M3-receptorok alloszterikus modulátoraként működik. Ezenkívül a DEET gátolja az AChE-t, ezáltal növeli az acetilkolin biológiai hozzáférhetőségét és az M3 receptorokhoz való kötődését, valamint fokozza a proangiogén hatásokat az alloszterikus szabályozás révén.
Az elsődleges EC-ket svájci egerek aortájából izoláltuk. Az extrakciós módszert a Kobayashi protokollból 26 adaptálták. Az egér EC-ket 5% hővel inaktivált FBS-sel kiegészített EBM-2 tápközegben tenyésztettük a negyedik passzázsig.
A DEET két koncentrációjának a HUVEC, U87MG vagy BF16F10 proliferációjára gyakorolt hatását a CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) segítségével elemeztük. Röviden, lyukanként 5,103 sejtet oltottunk egy 96 lyukú lemezre, hagytuk egy éjszakán át megtapadni, majd 24 órán át DEET-vel kezeltük. A táptalaj eltávolítása után adjunk festékmegkötő oldatot a mikrolemez minden egyes üregéhez, és inkubáljuk a sejteket 37 °C-on 30 percig. A fluoreszcenciaszinteket Mithras LB940 multimódusú mikrolemez-leolvasóval (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Németország) határoztuk meg, amely 485 nm-es gerjesztőszűrőkkel és 530 nm-es emissziós szűrőkkel volt felszerelve.
A HUVEC-et 96 lyukú lemezekre oltottuk 104 sejt/lyuk sűrűséggel. A sejteket 24 órán át DEET-vel kezeltük. A sejtek életképességét kolorimetriás MTT-vizsgálattal (Sigma-Aldrich, M5655) értékeltük. Az optikai sűrűség értékeket egy multimódusú mikrolemez-leolvasóval (Mithras LB940) kaptuk 570 nm hullámhosszon.
A DEET hatásait in vitro angiogenezis vizsgálatok segítségével tanulmányozták. A 10-8 M vagy 10-5 M DEET kezelés megnövelte a kapillárisok hosszának kialakulását HUVEC-ben (1a, b ábra, fehér oszlopok). A kontrollcsoporttal összehasonlítva a 10-14 és 10-5 M közötti DEET-koncentrációval végzett kezelés azt mutatta, hogy a kapillárisok hossza elérte a platót 10-8 M DEET-nél (S2 kiegészítő ábra). A 10-8 M és 10-5 M koncentráció tartományban DEET-vel kezelt HUVEC-k in vitro proangiogén hatásában nem találtunk szignifikáns különbséget.
A DEET neovaszkularizációra gyakorolt hatásának meghatározására in vivo neovaszkularizációs vizsgálatokat végeztünk. 14 nap elteltével a 10-8 M vagy 10-5 M DEET-tel előtenyésztett endoteliális sejtekkel injektált egerek hemoglobintartalma jelentős növekedést mutatott (1c. ábra, fehér oszlopok).
Ezenkívül a DEET-indukálta neovaszkularizációt U87MG xenograftot hordozó egereken tanulmányozták, amelyeket naponta (ip) injektáltak DEET-vel olyan dózisban, amelyről ismert, hogy 10-5 M plazmakoncentrációt indukál, ami normális az expozíciónak kitett embereknél. Kimutatható daganatokat (azaz >100 mm3 tumorokat) figyeltek meg 14 nappal az U87MG sejtek egerekbe történő injekciója után. A 28. napon a tumor növekedése szignifikánsan megnövekedett a DEET-kezelt egerekben a kontroll egerekhez képest (1d. ábra, négyzetek). Ezenkívül a daganatok CD31-es festése azt mutatta, hogy a DEET szignifikánsan növelte a kapillárisok területét, de nem növelte a mikroerek sűrűségét. (1e–g. ábra).
A muszkarin receptorok DETA által kiváltott proliferációban betöltött szerepének meghatározására 10-8 M vagy 10-5 M DETA-t használtunk pFHHSiD (10-7 M, szelektív M3 receptor antagonista) jelenlétében. HUVEC kezelése. A pFHHSiD minden koncentrációban teljesen blokkolta a DETA proliferatív tulajdonságait (1. táblázat).
Ilyen körülmények között azt is megvizsgáltuk, hogy a DEET növeli-e a kapillárisok hosszát a HUVEC sejtekben. Hasonlóképpen, a pFHHSiD szignifikánsan megakadályozta a DEET-indukált kapillárishosszt (1a., b. ábra, szürke sávok). Ezenkívül hasonló kísérleteket végeztek M3 siRNS-sel. Bár a kontroll siRNS nem volt hatékony a kapillárisképződés elősegítésében, az M3 muszkarin receptor elnémítása megszüntette a DEET azon képességét, hogy növelje a kapillárisok hosszát (1a, b ábra, fekete sávok).
Továbbá mind a 10-8 M vagy 10-5 M DEET-indukált vaszkularizációt in vitro és neovaszkularizációt in vivo teljesen blokkolta a pFHHSiD (1c, d ábra, körök). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a DEET elősegíti az angiogenezist a szelektív M3 receptor antagonistákra vagy M3 siRNS-re érzékeny útvonalon keresztül.
Az AChE a DEET molekuláris célpontja. Az olyan gyógyszerek, mint a donepezil, amelyek AChE-gátlóként működnek, stimulálhatják az EC angiogenezist in vitro és egér hátsó végtag-ischaemia modellekben14. Két koncentrációjú DEET hatását vizsgáltuk az AChE enzimaktivitásra HUVEC-ben. A DEET alacsony (10-8 M) és magas (10-5 M) koncentrációja csökkentette az endoteliális AChE aktivitást a kontroll körülményekhez képest (2. ábra).
A DEET mindkét koncentrációja (10-8 M és 10-5 M) csökkentette az acetilkolinészteráz aktivitást a HUVEC-en. Az acetilkolinészteráz inhibitorok kontrolljaként BW284c51-et (10-5 M) használtunk. Az eredményeket az AChE aktivitás százalékában fejezzük ki a két koncentrációjú DEET-vel kezelt HUVEC-en, összehasonlítva a hordozóval kezelt sejtekkel. Az értékeket hat független kísérlet átlag ± SEM értékében fejezzük ki. *p < 0,05 a kontrollhoz képest (Kruskal-Wallis és Dunn többszörös összehasonlító teszt).
A nitrogén-monoxid (NO) részt vesz az angiogén folyamatban 33, ezért a DEET-stimulált HUVEC-kben NO termelést vizsgáltunk. A DEET-kezelt endoteliális NO termelés megnövekedett a kontroll sejtekhez képest, de csak 10-8 M dózisnál érte el a szignifikanciát (3c. ábra). A DEET-indukálta NO termelést szabályozó molekuláris változások meghatározásához az eNOS expresszióját és aktivációját Western blottal elemeztük. Bár a DEET-kezelés nem változtatta meg az eNOS expresszióját, szignifikánsan megnövelte az eNOS foszforilációját az aktiválóhelyén (Ser-1177), miközben csökkentette a gátlóhelyét (Thr-495) a kezeletlen sejtekhez képest az eNOS foszforilációjában (3d. ábra). Ezenkívül kiszámítottuk a foszforilált eNOS arányát az aktiválási helyen és a gátló helyen, miután normalizáltuk a foszforilált eNOS mennyiségét az enzim teljes mennyiségéhez képest. Ez az arány szignifikánsan megnőtt az egyes DEET-koncentrációkkal kezelt HUVEC-sejtekben a kezeletlen sejtekhez képest (3d. ábra).
Végül az egyik fő proangiogén faktor, a VEGF expresszióját Western blottal elemeztük. A DEET szignifikánsan növelte a VEGF expressziót, míg a pFHHSiD teljesen blokkolta ezt az expressziót.
Mivel a DEET hatásai érzékenyek mind az M3-receptorok farmakológiai blokádjára, mind leszabályozására, teszteltük azt a hipotézist, hogy a DEET fokozhatja a kalcium jelátvitelt. Meglepő módon a DEET nem növelte a citoplazmatikus kalciumszintet a HUVEC-ben (az adatok nem láthatók) és a HEK/M3-ban (4a. és b. ábra) mindkét alkalmazott koncentrációnál.
Feladás időpontja: 2024. december 30