A peszticidek kritikus szerepet játszanak a globális élelmiszerhiány kezelésében és a vektorok által terjesztett emberi betegségek leküzdésében. A peszticidrezisztencia egyre növekvő problémája azonban sürgősen új vegyületek felfedezését igényli, amelyek a kihasználatlan célpontokat célozzák meg. A rovarok tranziens receptorpotenciál (TRPV) csatornái – a Nanzhong (Nan) és az inaktív (Iav) – heterológ csatornákat (Nan-Iav) alkothatnak, és a rovarokban a geotropizmust, a hallást és a propriocepciót közvetítő mechanoszenzoros szervekhez lokalizálódhatnak. Egyes peszticidek, mint például az aphidopirrolidon (AP), ismeretlen mechanizmusokon keresztül célozzák meg a Nan-Iav-ot. Az AP hatékony a szúró-szívó rovarok (félszárnyúak) ellen, megakadályozva a táplálkozást a filamentumok működésének megzavarásával. Az AP csak a Nan-hoz képes kötődni, de csak a Nan-Iav tud kölcsönhatásba lépni agonistákkal, beleértve az endogén nikotinamidot (NAM), ezáltal csatornaaktivitást mutatva. Annak ellenére, hogy a Nan-Iav potenciális rovarirtó célpont, keveset tudunk a csatornaösszeállításáról, szabályozó kötőhelyeiről és Ca2+-függő szabályozásáról, ami akadályozza a további rovarirtó szerek fejlesztését. Ebben a tanulmányban krioelektronmikroszkópiát alkalmaztunk a Nan-Iav szerkezetének meghatározására Hemiptera rovarokban kalmodulin-ligandummentes állapotban, valamint AP és NAM jelenlétében az ankyrin ismétlődő citoplazmatikus domén (ARD) határán. Meglepő módon azt találtuk, hogy maga a Nan fehérje is képes pentamert képezni, amelyet AP-közvetített ARD kölcsönhatások stabilizálnak. Ez a tanulmány a rovarölő szerek és agonisták, valamint a Nan-Iav közötti molekuláris kölcsönhatásokat tárja fel, kiemelve az ARD fontosságát a csatornák működésében és összeszerelésében, és feltárva a Ca2+ szabályozás mechanizmusát.
Az egyre súlyosbodó globális klímaváltozás hátterében a romló globális élelmezésbiztonság a 21. század egyik legnagyobb kihívása, amelynek a társadalomra nézve súlyos következményei vannak.1,2Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 2023-as élelmezésbiztonsági és táplálkozási helyzetről szóló (SOFI) jelentése szerint világszerte körülbelül 2,33 milliárd ember szenved közepes vagy súlyos élelmezésbizonytalanságtól, ami egy régóta fennálló probléma.3,4Sajnos a becslések szerint a terméshozamok 20-30%-a vagy még több is évente kártevők és kórokozók miatt veszít, és a globális felmelegedés várhatóan súlyosbítja a kártevőkkel szembeni ellenálló képességet és a növények sebezhetőségét.4, 5, 6, 7, 8A peszticidek fejlesztése nemcsak a növények kártevőktől való védelme és a vektorok által terjesztett kórokozók terjedésének csökkentése érdekében kritikus fontosságú, hanem a vektorok által terjesztett emberi betegségek, például a dengue-láz, a malária és a Chagas-kór leküzdésében is, amelyek egyre inkább ellenállnak a peszticideknek.5, 9, 10, 11
A neurotoxikus rovarirtó szerek fő célpontjai közül a Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) heterotetramer TRPV csatorna egy olyan rovarirtó célpontcsoportot képvisel, amelyet csak az elmúlt évtizedben fedeztek fel, beleértve a kereskedelmi forgalomban kapható rovarirtó szereket, mint például az imidakloprid és a piraklostrobin.12, 13, 14Az aphidopirrolifen (AP) félszintetikus rovarirtó szer egy nemrégiben kifejlesztett és kereskedelmi forgalomba hozott termék, amelynek fő összetevője az Inscalis® hatóanyagú rovarirtó, amely szubnanomoláris aktivitásszinten kötődik az AP-hez.15Az AP alacsony akut toxicitást mutat a beporzókkal, a hasznos rovarokkal és más nem célzott élőlényekkel szemben, és ha a címkén található utasításoknak megfelelően használják, csökkentheti a más rovarirtó szerekkel szembeni rezisztencia kialakulásának kockázatát.16, 17, 18A Nan és az Iav fehérjék széles körben elterjedtek a rovarfajok között, csak az antennák és a végtagok húrnyúlási receptor neuronjaiban expresszálódnak együtt, és kritikus fontosságúak a hallás, a gravitációérzékelés és a propriocepció szempontjából.13, 16, 19, 20, 21, 22Az AP, az imidakloprid és a piraklostrobin egyedi mechanizmuson keresztül stimulálja a Nan-Iav komplexet, végső soron gátolva a proprioceptív jelátvitelt.13, 16, 23A szúró-szívó rovaroknál (félszárnyúaknál), például a levéltetveknél és a fehérlegyeknél, a propriocepció elvesztése károsítja táplálkozási képességüket, ami végül halálhoz vezet.13,24Érdekes módon az AP nagy affinitást mutat a Nan-Iav komplexhez, és alacsony affinitást önmagában a Nanhoz. Az AP Nan-Iav-hoz való kötődése elektromos áramot indukál, de a Nanhoz való kötődés önmagában nem serkenti a csatorna aktivitását. Maga az Iav egyáltalán nem kötődik az AP-hez.16Ez arra utal, hogy a Nan és az Iav különböző Nan-Iav csatornakomplexeket alkotva kötődhetnek (pl. eltérő sztöchiometrikus arányokkal vagy ugyanazon sztöchiometrikus arányon belüli eltérő elrendeződésekkel), vagy hogy az AP több helyre is kötődhet. Továbbá, a természetes agonista nikotinamid (NAM) mikromoláris affinitással kötődik a Drosophila Nan-Iav-hoz, hasonló hatásokat mutatva, mint a levéltetvek (AP) in vitro hatásai.16,25és gátolja a levéltetvek szaporodását és táplálkozását, ami végül a pusztulásukhoz vezet25,26Ezek az adatok számos kérdést vetnek fel. Például továbbra sem világos, hogyan képződik a Nan-Iav heterodimer, mely kötőhelyek modulálják a kis molekulákat, és hogyan szabályozzák ezek a kis molekulák a csatornafunkciót a propriocepció elnyomásával. Továbbá, továbbra sem világos, hogy maga a Nan miért inaktív és alacsony affinitással rendelkezik az AP iránt, míg a Nan-Iav heterodimer aktív és nagyobb affinitással kötődik az AP-hez. Végül keveset tudunk a Nan-Iav funkció Ca2+-függő szabályozásáról és arról, hogyan integrálódik az idegi jelátviteli folyamatokba.13,21
Ebben a tanulmányban, a krioelektronmikroszkópia, az elektrofiziológia és a radioligandumkötési technikák ötvözésével, tisztáztuk a Nan-Iav összeszerelődését és a kis molekulájú szabályozókhoz való kötődésének mechanizmusát. Továbbá konstitutívan kötött kalmodulint (CaM) detektáltunk az Iav-hoz és AP-stabilizált Nan pentamereket. Ezek az eredmények fontos betekintést nyújtanak a kalciumionok szabályozásába a csatornákban, a csatorna-összeszerelődésbe és a ligandumkötési affinitást meghatározó tényezőkbe. Ami még fontosabb, megerősítettük, hogy az ARD központi szerepet játszik ezekben a folyamatokban. A releváns mezőgazdasági peszticidekhez kötődő teljes rovarcsatornák vizsgálata során...27, 28, 29új távlatokat nyit a növényvédőszer-ipar fejlődése előtt, javítja a növényvédő szerek hatékonyságát és specifikusságát, valamint lehetővé teszi a TRPV-célzott vegyületek más fajokon történő alkalmazását a globális élelmezésbiztonság és a vektorok által terjesztett betegségek terjedésének megfékezése érdekében.
Azt is megállapítottuk, hogy a Nan-Iav-t Ca2+ szabályozza, és a szabályozás mechanizmusát konstitutívan kötött CaM közvetíti. Fontos megjegyezni, hogy a Nav Ca2+-függő, CaM általi szabályozása jelentősen eltér más ioncsatornák (pl. feszültségfüggő Na+ csatornák és TRPV5/6 csatornák) szabályozási mechanizmusaitól.52, 53, 54, 55, 56, 57A Nav1.2 csatornában a CaM C-terminális doménje helikálisan kapcsolódik a C-terminális doménhez (CTD), és a Ca2+ indukálja az N-terminális doménjének kötődését a CTD disztális részéhez.56A TRPV5/6 csatornában a CaM C-terminális doménje kötődik a CTH-hoz, és a Ca2+ az N-terminális doménjének felfelé irányuló kiterjedését indukálja a pórusba, ezáltal blokkolva a kationpermeabilitást.53,54Javaslatot teszünk egy modellre a Nan-Iav-CaM Ca2+-szabályozott funkciójához (4h. ábra). Ebben a modellben a CaM N-terminális doménje konstitutívan kötődik az Iav C-terminális doménjéhez (CTH). Nyugalmi állapotban (alacsony [Ca2+] koncentráció) a CaM C-terminális doménje kölcsönhatásba lép a Nan-nal, stabilizálja az ARD konformációját, és ezáltal elősegíti a csatorna megnyílását. Egy agonista/rovarirtó szer csatornához való kötődése pórusnyitást indukál, ami Ca2+ beáramláshoz vezet. A Ca2+ ezután a CaM-hez kötődik, ami a C-terminális domén disszociációját okozza a Nan ARD-jéről. Mivel a CaM-kötés blokkolása lényegében megszünteti a Ca2+ gátló hatását, ez a disszociáció modulálja az ARD mobilitását, ezáltal Ca2+-függő gátlást vagy deszenzitizációt okoz. A csatornaáramok gyors helyreállása a kalciumion elúciója után (4g. ábra) arra utal, hogy ez a mechanizmus elősegíti a gyors válaszokat a Ca2+-közvetített neuronális jelekre. Továbbá az Iav C-terminális régiójáról, amelyről még mindig kevéssé ismertek a vizsgálatok, kimutatták, hogy más szerepet is játszik a csatorna-célzásban és az áramszabályozásban.21
Végül, tanulmányunk bemutatja egy mezőgazdasági jelentőségű rovarirtó-rovarirtó TRP-csatorna komplex nagy felbontású szerkezetét – egy olyan felfedezést, amely korábban ismeretlen volt számunkra. Nevezetesen, a rovarcsatorna szerkezetét és funkcióját emberi sejtekben (HEK293S GnTi–) jellemeztük, nem pedig rovarsejtekben. A növekvő rovarirtó rezisztencia és az élelmezésbiztonságra, valamint a kórokozókra nehezedő folyamatos nyomás közepette munkánk fontos információkkal szolgál, amelyek elősegítik az új rovarirtó szerek kifejlesztését az emberi egészség és a globális élelmezésbiztonság érdekében. Tanulmányok kimutatták, hogy az olyan rovarirtó szerek, mint az AP, hatékonyak egyes kártevőkkel szemben, ha a címkén található utasításoknak megfelelően használják, és alacsony akut toxicitást mutatnak a hasznos beporzókra, ami bizonyítja környezeti biztonságosságukat.13,16Továbbá, egyes AP-származékok szúnyogokon végzett vizsgálata kimutatta, hogy azok végül elveszítik repülési képességüket. Annak megértése, hogy ezek a moduláló vegyületek hogyan kötődnek a Nan-Iav-hoz, megkönnyíti a meglévő vegyületek módosítását vagy új vegyületek kifejlesztését a hatékonyabb és hatékonyabb felhasználás érdekében.pontoskártevőirtás. Tanulmányunk azt mutatja, hogy a Nan-Iav ARD határfelület nemcsak az endogén vegyületek, peszticidek és Ca2+-CaM aktivitásának szabályozásában kritikus, hanem a csatorna-összeszerelődésben is. Azt feltételezzük, hogy a heterodimer-összeszerelődés kis molekulákkal történő megszakítása egyedülálló és ígéretes megközelítés lehet az ioncsatorna-gátlók fejlesztésében.
A nyolc ortológ gén közül a barna bogár (Halyomorpha halys) Nanchung és Inactive teljes hosszúságú génjeit választottuk ki, amelyek kiváló stabilitást mutattak detergensekben. A szintetizált géneket kodonoptimalizáltuk emberi expresszióra, és XhoI és EcoRI restrikciós helyek segítségével pBacMam pCMV-DEST vektorba klónoztuk. Ez biztosította, hogy a klónok a C-terminális GFP-FLAG-10xHis és mCherry-FLAG-10xHis tagekkel keretben legyenek, amelyeket a HRC-3C proteáz (PPX) hasít, lehetővé téve a függetlenkifejezésA Nanchung és az Inactive pBacMam vektorba klónozásához használt primerek a következők voltak:
Az egyes részecskék mikroszkópos képeit Titan Krios G2 transzmissziós elektronmikroszkópon (FEI) készítettük, amely K3 kamerával és Gatan BioQuantum energiaszűrővel volt felszerelve. A mikroszkópot 300 keV feszültséggel, 20 eV energiabeállítással, 1,08 Å/pixel minta pixelmérettel (81 000-szeres névleges nagyítás) és -0,8 és -2,2 μm közötti defókuszgradienssel működtettük. A videofelvételt 40 képkocka/másodperc sebességgel végeztük Latitude S mikroszkóppal (Gatan), 25 e–px−1 s−1 névleges dózisteljesítménnyel, 2,4 s expozíciós idővel és körülbelül 60 e–Å−2 teljes dózissal.
A nyaláb által kiváltott mozgáskorrekciót és a dózissúlyozást filmen végezték a MotionCor2 szoftverrel a RELION 4.061 szoftverben. A kontrasztátviteli függvény (CTF) paraméterbecslését a cryoSPARC programban a foltalapú CTF becslési módszerrel62 végezték. A ≥4 Å CTF illesztési felbontással rendelkező mikrofotográfiákat kizárták a későbbi elemzésből. A cryoSPARC programban jellemzően 500–1000 mikrofotográfiából álló részhalmazt használtak a pontkiválasztáshoz, majd a szűrés után több 2D osztályozási kört végeztek, hogy egyértelmű referenciaképet kapjanak a templátalapú részecskekiválasztáshoz. A részecskéket ezután 64 pixeles határoló dobozok és 4-szeres binning segítségével extrahálták. A nem kívánt részecskekategóriák eltávolítása érdekében több 2D osztályozási kört végeztek. A kezdeti 3D modellt ab initio rekonstrukcióval rekonstruálták, és nem egyenletes finomítással finomították a cryoSPARC programban. A 3D osztályozást cryoSPARC vagy RELION programban az ARD heterogenitás alapján végezték. A membrándomének szignifikáns heterogenitását nem figyelték meg. A részecskéket C1 és C2 módszerekkel finomították; A nagyobb C2 felbontású részecskéket a C2-höz képest szimmetrikusnak tekintették, és a RELION-ba importálták Bayes-finomítás céljából. A részecskéket ezután visszavitték a cryoSPARC-ba a végső nem egyenletes és lokális finomításhoz. A végső felbontást és a részecskeszámot az 1. táblázat mutatja.
A Nan+AP pentamerek feldolgozása során különféle módszereket vizsgáltunk a membrándomének (különösen a pórusrégió) felbontásának javítására, mint például a jelkivonás és a TMD-maszkolás. Ezek a kísérletek azonban sikertelenek voltak a pórusrégió potenciálisan extrém rendezetlensége és a TMD általános heterogenitása miatt. A végső felbontást a cryoSPARC nemegyenletes feldolgozási módszere által automatikusan generált maszk segítségével számítottuk ki, elsősorban az ARD régiót célozva meg. Ez jelentősen nagyobb felbontást ért el, mint a membrándomének (különösen a VSLD régió) felbontása.
A Nanchung és az inaktív bogarak apo formáinak kezdeti de novo modelljeit először Coot63 programmal, majd a Nan és Iav bogarak modelljeit AlphaFold264 programmal generáltuk az alacsony megbízhatóságú régiók azonosítására. A kalmodulin modellezés a Ca2+-kötő és Ca2+-mentes modellek merev test illesztésein alapult a 4JPZ56 és 1CFD65 PDB hozzáférésekben. A modelleket gömbi finomítással finomítottuk a helyes sztereokémia és a jó geometria biztosítása érdekében. A foszfatidilkolint, a foszfatidiletanolamint és a foszfatidilszerint ezután jól definiált lipidsűrűségekként modelleztük, és a NAM és AP ligandumokat a megfelelő sűrűségekbe helyeztük a szoros csatlakozásokban. Az izoformák SMILES karakterláncából korlátozó fájlokat generáltunk az eLBOW programmal a PHENIX66-ban. Végül a modelleket valós térben finomítottuk a PHENIX-ben lokális rácskereséssel és globális minimalizálással, másodlagos szerkezeti korlátozásokkal. A modell finomításához és a szerkezeti elemzéshez a MolProbity szervert használtuk, az illusztrációkat pedig PyMOL és UCSF Chimera X segítségével végeztük.67,68,69 Az apertúra-analízist a HOLE szerverrel,70 a szekvencia-megőrzési térképezést pedig a Consurf szerverrel végeztük.71
A statisztikai elemzést Igor Pro 6.2, Excel Office 365 és GraphPad Prism 7.0 szoftverekkel végeztük. Minden kvantitatív adatot átlag ± standard hiba (SEM) formájában adunk meg. Két csoport összehasonlítására Student-féle t-próbát (kétoldali, párosítatlan) alkalmaztunk. Több csoport összehasonlítására egyutas varianciaanalízist (ANOVA), majd Dunnett-féle post hoc tesztet alkalmaztunk. *P< 0,05, **P< 0,01, és ***PA < 0,001 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak az adateloszlástól függően. A Kd és Ki értékeket, valamint azok aszimmetrikus 95%-os konfidencia intervallumait a GraphPad Prism 10 szoftverrel számítottuk ki.
A tanulmány módszertanával kapcsolatos további részletekért lásd a Nature Portfolio Report Summary-t, amelyhez ebben a cikkben link tartozik.
A kezdeti modellt a PDB 4JPZ és 1CFD adatbázisokból származó kalmodulin modellek felhasználásával építettük fel. A koordinátákat a Protein Data Bankban (PDB) a következő hozzáférési számokon helyezték el: 9NVN (Nan-Iav-CaM ligand nélkül), 9NVO (Nan-Iav-CaM nikotinamidhoz kötve), 9NVP (Nan-Iav-CaM nikotinamidhoz és EDTA-hoz kötve), 9NVQ (Nan-Iav-CaM apenidolpirrolinhoz és kalciumhoz kötve), 9NVR (Nan-Iav-CaM apenidolpirrolinhoz és EDTA-hoz kötve), és 9NVS (Nan-pentamer apenidolpirrolinhoz kötve). A megfelelő krioelektronmikroszkópos képek az Elektronmikroszkópos Adatbázisban (EMDB) a következő hozzáférési számok alatt találhatók: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ligand nélkül), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM komplex nikotinamiddal), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM komplex nikotinamiddal és EDTA-val), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM komplex apidopirrolinnal és kalciummal), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM komplex apidopirrolinnal és EDTA-val), és EMD-49849 (Nan pentamer komplex apidopirrolinnal). A funkcionális elemzéshez szükséges nyers adatokat ebben a cikkben mutatjuk be.
Közzététel ideje: 2026. január 28.