Növényi és kórokozó anyagok
A cirok konverziós populáció (SCP) néven ismert ciroktársítási populációt Dr. Pat Brown biztosította az Illinoisi Egyetemről (jelenleg UC Davis). Korábban már leírták, és különböző vonalak gyűjteménye, amelyeket fényperiódus-érzéketlenségre és kisebb termetre alakítottak át, hogy megkönnyítsék a növények növekedését és fejlődését az Egyesült Államokban. Ebből a populációból 510 vonalat használtak fel ebben a vizsgálatban, bár a rossz csírázás és más minőség-ellenőrzési problémák miatt nem minden vonalat használtak mindhárom tulajdonság elemzéséhez. Végül 345 vonal adatait használták fel a kitin válasz elemzésére, 472 vonalat az flg22 válaszra és 456 vonalat a TLS rezisztenciára.B. cookeiAz LSLP18 törzset Dr. Burt Bluhmtól szereztük be az Arkansas Egyetemen.
MAMP válasz mérés
Ebben a vizsgálatban két különböző MAMP-ot használtunk, az flg22-t (Genscript Katalógusszám RP19986) és a kitint. A ciroknövényeket talajjal (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) töltött lapokra fektetett betétekben termesztettük üvegházban. A növényeket a mintavétel előtti napon öntöztük, hogy elkerüljük a levelek extra nedvességét a gyűjtés napján.
A vonalakat véletlenszerűen kiválasztották, és logisztikai okokból 60 sorból álló tételekben telepítették őket. Minden vonalhoz három „cserepet” ültettünk el, soronként két maggal. A következő tételeket az előző tétel feldolgozása után azonnal elültettük, amíg a teljes populációt fel nem értékelték. Mindkét MAMP-ra két kísérleti futtatást végeztünk, a genotípusokat mind a két futtatásban újrarandomizáltuk.
A ROS vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük. Röviden, minden vonalhoz hat magot ültettünk el 3 különböző cserépben. A kapott palánták közül hármat választottunk ki az egyöntetűség alapján. Nem használtak olyan palántákat, amelyek szokatlannak tűntek, vagy lényegesen magasabbak vagy alacsonyabbak voltak, mint a többség. Három különböző 15 napos cirok növény 4. levelének legszélesebb részéből négy 3 mm átmérőjű levélkorongot vágtunk ki. Két növény levelénként egy korong, egy növényből két korong, a második korong a vízszabályozás (lásd alább). A korongokat egyenként 50 µl vízen lebegtetjük egy fekete 96 lyukú lemezen, alumínium lezárással lezárjuk, hogy elkerüljük a fény hatását, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartottuk. Másnap reggel reakcióoldatot készítettek 2 mg/ml kemilumineszcens L-012 szondával (Wako, katalógusszám 120-04891), 2 mg/ml torma-peroxidázzal (VI-A típus, Sigma-Aldrich, katalógusszám: P6782) és 100 mg/ml kitinnel vagy 2 µM Flg-vel. Ebből a reakcióoldatból 50 µl-t adtunk a négy üreg közül háromhoz. A negyedik lyuk egy álkontroll volt, amelyhez a MAMP-ot nem tartalmazó reakcióoldatot adtuk. Mindegyik lemezhez négy üres üreget is helyeztünk, amelyek csak vizet tartalmaztak.
A reakcióoldat hozzáadása után a lumineszcenciát SynergyTM 2 multidetection microplate reader (BioTek) segítségével mértük 2 percenként 1 órán keresztül. A lemezolvasó ezen 1 óra alatt 2 percenként lumineszcencia méréseket végez. Mind a 31 leolvasás összegét kiszámítottuk, hogy megkapjuk az egyes lyukak értékét. A MAMP-válasz becsült értékét minden genotípusra a következőképpen számítottuk ki (a három kísérleti üreg átlagos lumineszcenciaértéke – a próbaüreg értéke) - mínusz az átlagos vaküreg érték. A vaküreg értékei következetesen nulla közelében voltak.
LevéltárcsákNicotiana benthamiana, egy jól reagáló cirok vonal (SC0003) és egy alacsony érzékenységű cirok vonal (PI 6069) szintén bekerült kontrollként minden 96 lyukú lemezbe minőség-ellenőrzési célokra.
B. cookeioltóanyag előkészítése és beoltása
B. cookeioltóanyagot a korábban leírtak szerint készítettünk. Röviden, a cirokszemeket három napig vízben áztattuk, leöblítettük, 1 literes Erlenmeyer-lombikokba kanalaztuk, és egy órán át 15 psi nyomáson és 121 °C-on autoklávoztuk. A szemeket ezután körülbelül 5 ml friss tenyészetből származó macerált micéliummal oltottuk beB. cookeiAz LSLP18 izolálja és 2 hétig szobahőmérsékleten állni hagyja, a lombikokat 3 naponta megrázva. 2 hét elteltével a gombával fertőzött cirokszemeket levegőn szárítottuk, majd a szántóföldi oltásig 4 °C-on tároltuk. Ugyanazt az oltóanyagot használták a teljes kísérlet során, és minden évben frissen készítették. Az oltáshoz 6-10 fertőzött szemet helyeztünk a 4-5 hetes cirok növények örvényébe. Az ezekből a gombákból termelődő spórák egy héten belül megindították a fertőzést a fiatal ciroknövényekben.
Vetőmag előkészítése
A szántóföldi kiültetés előtt a cirok magját gombaölő, rovarirtó és védőanyag keverékkel kezeltük, amely ~ 1% Spirato 480 FS gombaölő szert, 4% Sebring 480 FS gombaölő szert, 3% Sorpro 940 ES magvédő szert tartalmazott. Ezután a magokat levegőn szárítottuk 3 napig, ami vékony bevonatot biztosított ebből a keverékből a magok körül. A védőanyag lehetővé tette a Dual Magnum gyomirtó szer használatát kikelés előtti kezelésként.
A céllevélfoltosság-ellenállás értékelése
Az SCP-t 2017. június 14–15-én és 2018. június 20-án a Clayton állambeli Central Crops Research Station-ben ültették el randomizált teljes blokktervezésben, minden esetben két kísérleti megismétléssel. A kísérleteket 1,8 m-es, egysoros, 0,9 m-es sorszélességű sorokba ültettük, parcellánként 10 maggal. Minden kísérlet perifériájára két szegélysort ültettünk, hogy elkerüljük a peremhatásokat. A kísérleteket 2017. július 20-án és 2018. július 20-án oltottuk be, amikor is a cirok növények a 3. növekedési szakaszban voltak. Az értékeléseket egytől kilencig terjedő skálán vették fel, ahol a betegség jeleit nem mutató növényeket kilencre, a teljesen elpusztult növényeket pedig egyre értékelték. Két értékelést végeztek 2017-ben és négy mérést 2018-ban, minden évben az oltás után két héttel. Az sAUDPC-t (standardizált terület a betegség progressziós görbéje alatt) a korábban leírtak szerint számítottuk ki.
Feladás időpontja: 2021-01-01