Növényi és kórokozó anyagok
Egy cirok asszociációtérképező populációt, az úgynevezett cirokkonverziós populációt (SCP) Dr. Pat Brown biztosított az Illinois-i Egyetemről (jelenleg a UC Davisen). A populációt korábban már leírták, és különféle vonalak gyűjteménye, amelyeket fotoperiódus-érzéketlenné és kisebb termetűvé alakítottak át, hogy elősegítsék a növények növekedését és fejlődését az amerikai környezetben. Ebből a populációból 510 vonalat használtak fel ebben a vizsgálatban, bár a rossz csírázás és egyéb minőségellenőrzési problémák miatt nem minden vonalat használtak fel mindhárom tulajdonság elemzéséhez. Végül 345 vonal adatait használták fel a kitinválasz, 472 vonalét az flg22 válasz, és 456 vonalét a TLS-rezisztencia elemzéséhez.B. cookeiAz LSLP18 törzset Dr. Burt Bluhm-tól szereztük be az Arkansasi Egyetemről.
MAMP válasz mérése
Két különböző MAMP-ot használtunk ebben a vizsgálatban: flg22-t (Genscript katalógusszám: RP19986) és kitint. A ciroknövényeket földdel (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) feltöltött lapokra helyezett betétekben neveltük az üvegházban. A növényeket a mintavétel előtti napon megöntöztük, hogy elkerüljük a gyűjtés napján a felesleges levélnedvességet.
A vonalakat véletlenszerűen osztották szét, és logisztikai okokból 60 vonalas tételekben ültették el. Minden vonalhoz három „cserepet” ültettek el, soronként két maggal. A következő tételeket az előző tétel feldolgozása után azonnal elültették, amíg a teljes populációt fel nem mérték. Mindkét MAMP esetében két kísérleti futtatást végeztek, a genotípusokat mindkét futtatásban újra véletlenszerűen osztották szét.
A ROS-vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük. Röviden, minden vonalból hat magot ültettünk 3 különböző cserépbe. A kapott palántákból hármat az egyformaság alapján választottunk ki. A szokatlannak tűnő, illetve a többségnél lényegesen magasabb vagy alacsonyabb palántákat nem használtuk fel. Négy, 3 mm átmérőjű levélkorongot vágtunk ki három különböző 15 napos ciroknövény 4. levelének legszélesebb részéből. Két növényről levélenként egy korongot, egy növényről pedig két korongot, a második korong pedig a vízkontroll szerepét töltötte be (lásd alább). A korongokat egyenként 50 µl H20-on úsztattuk egy fekete 96 lyukú lemezen, alumíniumzárral lezártuk a fénytől való védelem érdekében, majd szobahőmérsékleten tartottuk egy éjszakán át. Másnap reggel reakcióoldatot készítettünk 2 mg/ml kemilumineszcens L-012 szondával (Wako, katalógusszám: 120-04891), 2 mg/ml torma-peroxidázzal (VI-A típus, Sigma-Aldrich, katalógusszám: P6782) és 100 mg/ml kitinnel vagy 2 μM Flg22-vel. Ebből a reakcióoldatból 50 µl-t adtunk a négy kútból háromhoz. A negyedik kút egy kontroll kút volt, amelyhez a MAMP nélküli reakcióoldatot adtuk. Mindegyik lemezen négy üres, csak vizet tartalmazó kút is volt.
A reakcióoldat hozzáadása után a lumineszcenciát Synergy™ 2 többfunkciós mikroplate-leolvasóval (BioTek) mértük 2 percenként 1 órán keresztül. A lemezleolvasó 2 percenként végez lumineszcencia-méréseket ez alatt az 1 óra alatt. Az összes 31 leolvasás összegéből megkaptuk az egyes kút értékeket. Az egyes genotípusok MAMP-válaszának becsült értékét a következőképpen számítottuk ki: (a három kísérleti kút átlagos lumineszcencia-értéke - a kontroll kút értéke) - mínusz az átlagos vak kút érték. A vak kút értékek következetesen közel nullák voltak.
LevélkorongokNicotiana benthamianaMinőség-ellenőrzési célból minden 96 lyukú lemezen egy nagy válaszkészségű cirokvonalat (SC0003) és egy alacsony válaszkészségű cirokvonalat (PI 6069) is kontrollként alkalmaztunk.
B. cookeioltóanyag-előkészítés és beoltás
B. cookeiAz inokulumot a korábban leírtak szerint készítettük el. Röviden, a cirokszemeket három napig vízben áztattuk, leöblítettük, 1 literes Erlenmeyer-lombikokba kanalaztuk, és egy órán át autoklávoztuk 15 psi nyomáson és 121 °C-on. A szemeket ezután körülbelül 5 ml friss ciroktenyészetből származó macerált micéliummal oltottuk be.B. cookeiLSLP18 izolátumokat izoláltunk, és 2 hétig szobahőmérsékleten hagytuk, a lombikokat 3 naponta megrázva. 2 hét elteltével a gombával fertőzött cirokszemeket levegőn szárítottuk, majd 4 °C-on tároltuk a terepi beoltásig. Ugyanazt az oltóanyagot használtuk a teljes kísérlet során, és minden évben frissen készítettük el. Beoltáshoz 6-10 fertőzött szemet helyeztünk 4-5 hetes ciroknövények örvébe. Az ezekből a gombákból termelt spórák egy héten belül elindították a fertőzést a fiatal ciroknövényekben.
Vetőmag-előkészítés
A szántóföldre vetés előtt a cirokmagokat gombaölő, rovarölő és védőanyag keverékével kezelték, amely ~1% Spirato 480 FS gombaölőt, 4% Sebring 480 FS gombaölőt és 3% Sorpro 940 ES vetőmag-védőanyagot tartalmazott. Ezután a magokat 3 napig levegőn szárították, így a keverék vékony bevonatot képezett a magok körül. A védőanyag lehetővé tette a Dual Magnum gyomirtó szer használatát preemergens kezelésként.
Célzott levélfoltosság-rezisztencia értékelése
Az SCP-t a claytoni (Észak-Karolina) Central Crops Research Stationban ültették el 2017. június 14–15-én és 2018. június 20-án, randomizált, teljes blokkos elrendezésben, minden kísérleti ismétléssel. A kísérleteket 1,8 m-es, 0,9 m-es sortávolságú, parcellánként 10 magot elültetve egyetlen sorba ültették. Minden kísérlet kerülete mentén két szegélysort ültettek a szegélyhatások elkerülése érdekében. A kísérleteket 2017. július 20-án és 2018. július 20-án oltották be, ekkor a ciroknövények a 3. növekedési szakaszban voltak. Az értékelést egytől kilencig terjedő skálán végezték, ahol a betegség jeleit nem mutató növényeket kilencessel, a teljesen elpusztult növényeket pedig egyessel értékelték. 2017-ben két, 2018-ban pedig négy értékelést végeztek, minden évben a beoltás után két héttel kezdve. Az sAUDPC-t (a betegség progressziós görbe alatti standardizált területet) a korábban leírtak szerint számították ki.
Közzététel ideje: 2021. április 1.