Növényi és kórokozó anyagok
A cirok konverziós populáció (SCP) néven ismert ciroktársítási populációt Dr. Pat Brown biztosította az Illinoisi Egyetemről (jelenleg UC Davis).Korábban már leírták, és különböző vonalak gyűjteménye, amelyeket fényperiódus-érzéketlenségre és kisebb termetre alakítottak át, hogy megkönnyítsék a növények növekedését és fejlődését az Egyesült Államokban.Ebből a populációból 510 vonalat használtak fel ebben a vizsgálatban, bár a rossz csírázás és más minőség-ellenőrzési problémák miatt nem minden vonalat használtak mindhárom tulajdonság elemzéséhez.Végül 345 vonal adatait használták fel a kitin-válasz elemzésére, 472 vonalat az flg22-válaszra és 456-ot a TLS-rezisztenciára.B. cookeiAz LSLP18 törzset Dr. Burt Bluhmtól szereztük be az Arkansas Egyetemen.
MAMP válasz mérés
Ebben a vizsgálatban két különböző MAMP-ot használtunk, az flg22-t (Genscript Katalógusszám RP19986) és a kitint.A ciroknövényeket talajjal (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) töltött lapokra fektetett betétekben termesztettük üvegházban.A növényeket a mintavétel előtti napon öntöztük, hogy elkerüljük a levelek extra nedvességét a gyűjtés napján.
A vonalakat véletlenszerűen választották ki, és logisztikai okokból 60 sorból álló tételekben telepítették őket.Minden vonalhoz három „cserepet” ültettünk el, soronként két maggal.A következő tételeket az előző tétel feldolgozása után azonnal elültettük, amíg a teljes populációt fel nem értékelték.Mindkét MAMP-ra két kísérleti futtatást végeztünk, a genotípusokat mind a két futtatásban újrarandomizáltuk.
A ROS vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük.Röviden, minden vonalhoz hat magot ültettünk el 3 különböző cserépben.A kapott palánták közül hármat választottunk ki az egyöntetűség alapján.Nem használtak olyan palántákat, amelyek szokatlannak tűntek, vagy lényegesen magasabbak vagy alacsonyabbak voltak, mint a többség.Három különböző 15 napos cirok növény 4. levelének legszélesebb részéből négy 3 mm átmérőjű levélkorongot vágtunk ki.Két növény levelénként egy korong, egy növényből két korong, a második korong a vízszabályozás (lásd alább).A korongokat egyenként 50 µl vízen lebegtetjük egy fekete 96 lyukú lemezen, alumínium lezárással lezárjuk, hogy elkerüljük a fény hatását, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartottuk.Másnap reggel reakcióoldatot készítettek 2 mg/ml kemilumineszcens L-012 szondával (Wako, katalógusszám 120-04891), 2 mg/ml torma-peroxidázzal (VI-A típus, Sigma-Aldrich, katalógusszám P6782), és 100 mg/ml kitin vagy 2 μM Flg22.Ebből a reakcióoldatból 50 µl-t adtunk a négy üreg közül háromhoz.A negyedik lyuk egy álkontroll volt, amelyhez a MAMP-ot nem tartalmazó reakcióoldatot adtuk.Mindegyik lemezhez négy üres üreget is helyeztünk, amelyek csak vizet tartalmaztak.
A reakcióoldat hozzáadása után a lumineszcenciát SynergyTM 2 multidetection microplate reader (BioTek) segítségével mértük 2 percenként 1 órán keresztül.A lemezolvasó ezen 1 óra alatt 2 percenként lumineszcencia méréseket végez.Mind a 31 leolvasás összegét kiszámítottuk, hogy megkapjuk az egyes lyukak értékét.A MAMP-válasz becsült értékét minden genotípusra a következőképpen számítottuk ki (a három kísérleti üreg átlagos lumineszcenciaértéke – a próbaüreg értéke) - mínusz az átlagos vaküreg érték.A vaküreg értékei következetesen nulla közelében voltak.
LevéltárcsákNicotiana benthamiana, egy jól reagáló cirok vonal (SC0003) és egy alacsony érzékenységű cirok vonal (PI 6069) szintén kontrollként szerepelt minden 96 lyukú lemezen minőség-ellenőrzési célból.
B. cookeioltóanyag előkészítése és beoltása
B. cookeiinokulum a korábban leírtak szerint készült.Röviden, a cirokszemeket három napig vízben áztattuk, leöblítettük, 1 literes Erlenmeyer-lombikokba kanalaztuk, és egy órán át 15 psi nyomáson és 121 °C-on autoklávoztuk.A szemeket ezután körülbelül 5 ml friss tenyészetből származó macerált micéliummal oltottuk beB. cookeiAz LSLP18 izolálja és 2 hétig szobahőmérsékleten állni hagyja, a lombikokat 3 naponta megrázva.2 hét elteltével a gombával fertőzött cirokszemeket levegőn szárítottuk, majd a szántóföldi oltásig 4 °C-on tároltuk.Ugyanazt az oltóanyagot használták a teljes kísérlet során, és minden évben frissen készítették.Az oltáshoz 6-10 fertőzött szemet helyeztünk a 4-5 hetes cirok növények örvényébe.Az ezekből a gombákból termelődő spórák egy héten belül megindították a fertőzést a fiatal ciroknövényekben.
Vetőmag előkészítése
A szántóföldi kiültetés előtt a cirok magját gombaölő, rovarirtó és védőanyag keverékkel kezeltük, amely ~ 1% Spirato 480 FS gombaölő szert, 4% Sebring 480 FS gombaölő szert, 3% Sorpro 940 ES magvédő szert tartalmazott.Ezután a magokat levegőn szárítottuk 3 napig, ami vékony bevonatot biztosított ebből a keverékből a magok körül.A védőanyag lehetővé tette a Dual Magnum gyomirtó szer használatát kikelés előtti kezelésként.
A céllevélfoltos ellenállás értékelése
Az SCP-t 2017. június 14–15-én és 2018. június 20-án a Clayton állambeli Central Crops Research Station-ben ültették el randomizált teljes blokktervezésben, minden esetben két kísérleti megismétléssel.A kísérleteket 1,8 m-es, egysoros, 0,9 m-es sorszélességű sorokba ültettük, parcellánként 10 maggal.Minden kísérlet perifériájára két szegélysort ültettünk, hogy elkerüljük a peremhatásokat.A kísérleteket 2017. július 20-án és 2018. július 20-án oltottuk be, amikor is a cirok növények a 3. növekedési stádiumban voltak. Az értékelések egytől kilencig terjedő skálán történtek, ahol a betegség jeleit nem mutató növényeket kilencre értékelték, és teljesen az elhullott növényeket egyként értékelték.Két értékelést végeztek 2017-ben és négy mérést 2018-ban, minden évben az oltás után két héttel.Az sAUDPC-t (standardizált terület a betegség progressziós görbéje alatt) a korábban leírtak szerint számítottuk ki.
Feladás időpontja: 2021-01-01